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補(bǔ)體介導(dǎo)的成熟紅細(xì)胞（RBCs）裂解會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的溶血疾病。近期，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院的團(tuán)隊(duì)在《Cell》上發(fā)表了題為“Red blood cells undergo lytic programmed cell death involving NLRP3”的文章。本研究結(jié)果表明，補(bǔ)體激活可介導(dǎo)成熟紅細(xì)胞中NLRP3-ASC-caspase-8復(fù)合物的組裝，導(dǎo)致β-血影蛋白的水解以及細(xì)胞骨架完整性的破壞。從而誘導(dǎo)紅細(xì)胞發(fā)生連續(xù)的形態(tài)變化，并導(dǎo)致溶血。

圖1. 抑制NLRP3信號(hào)傳導(dǎo)可減少補(bǔ)體誘導(dǎo)的紅細(xì)胞程序性死亡

（圖片源自《Cell》）

研究者首先收集了純化的成熟人紅細(xì)胞，并基于ABO血型激活補(bǔ)體建立了體外模型，以表征補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血。與對(duì)照組相比，激活補(bǔ)體組上清液中游離血紅蛋白（Hb）的濃度顯著升高。并且在激活補(bǔ)體組中觀察到了異形紅細(xì)胞和紅細(xì)胞影。這些發(fā)現(xiàn)表明補(bǔ)體激活介導(dǎo)了溶血。進(jìn)一步通過(guò)掃描顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞從圓盤狀到影細(xì)胞的形態(tài)變化并非同步發(fā)生。但經(jīng)補(bǔ)體刺激后，幾乎所有的紅細(xì)胞都會(huì)經(jīng)歷這種變形過(guò)程。伴隨著這些形態(tài)變化，上清液中Hb的濃度相應(yīng)增加。綜合來(lái)看，這些發(fā)現(xiàn)表明，在補(bǔ)體誘導(dǎo)的溶血過(guò)程中，成熟紅細(xì)胞會(huì)經(jīng)歷一系列形態(tài)變化，表明在溶血過(guò)程中人成熟紅細(xì)胞的損傷可能涉及細(xì)胞程序性死亡。

圖2. 補(bǔ)體激活可誘導(dǎo)溶血過(guò)程中紅細(xì)胞的一系列形態(tài)學(xué)變化

（圖片源自《Cell》）

隨后，研究人員給成熟紅細(xì)胞施用了細(xì)胞焦亡、細(xì)胞凋亡、鐵死亡和壞死性凋亡的抑制劑，以進(jìn)一步探究補(bǔ)體誘導(dǎo)的成熟紅細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡。值得注意的是，泛半胱天冬酶抑制劑顯著降低了補(bǔ)體誘導(dǎo)的血紅蛋白釋放以及球形紅細(xì)胞與影細(xì)胞的比例，這表明補(bǔ)體誘導(dǎo)的溶血可能主要依賴于半胱天冬酶的活性。接著，作者又用一系列半胱天冬酶抑制劑來(lái)確定是哪一種半胱天冬酶參與了溶血過(guò)程。結(jié)果表明，caspase-8抑制劑Z-IETD-FMK和caspase-3抑制劑Ac-DEVD-CHO均能有效抑制補(bǔ)體誘導(dǎo)的血紅蛋白釋放，并降低球形紅細(xì)胞與影細(xì)胞的比例，且caspase-8抑制劑的抑制作用更顯著。同時(shí)，作者在補(bǔ)體激活組中也檢測(cè)到了caspase-8的激活。另外，在補(bǔ)體激活組紅細(xì)胞中裂解的caspase-8信號(hào)逐漸增強(qiáng)；在棘形紅細(xì)胞I型和II型以及球形紅細(xì)胞中裂解的caspase-8的熒光強(qiáng)度顯著高于圓盤形紅細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)表明，caspase-8活性是補(bǔ)體誘導(dǎo)的紅細(xì)胞程序性死亡的主導(dǎo)者。

圖3. 活化的caspase-8在補(bǔ)體誘導(dǎo)的紅細(xì)胞死亡中起關(guān)鍵作用

（圖片源自《Cell》）

有研究表明補(bǔ)體系統(tǒng)可激活巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞中的NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLPR3）炎性小體，且NLPR3-凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白ASC復(fù)合物會(huì)利用caspase-8形成非經(jīng)典的NLRP3復(fù)合物?；诖耍髡呒僭O(shè)成熟紅細(xì)胞中被激活的NLPR3可能會(huì)激活caspase-8。觀察到NLPR3抑制劑MCC950也降低了補(bǔ)體誘導(dǎo)的Hb的釋放，并減少了人紅細(xì)胞中球形紅細(xì)胞與影紅細(xì)胞的比例，這表明紅細(xì)胞NLRP3參與了補(bǔ)體誘導(dǎo)的溶血。此外，MCC950處理顯著減少了裂解的caspase-8陽(yáng)性紅細(xì)胞的數(shù)量，并減弱了caspase-8的激活。綜上所述，這些結(jié)果表明激活的補(bǔ)體介導(dǎo)了成熟紅細(xì)胞中NLRP3-ASC-caspase-8復(fù)合物的組裝。

圖4. 補(bǔ)體激活介導(dǎo)成熟紅細(xì)胞中NLRP3-ASC-caspase-8復(fù)合物的組裝

（圖片源自《Cell》）

接下來(lái)，作者對(duì)補(bǔ)體激活紅細(xì)胞組和對(duì)照組進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，基因本體論（GO）分析顯示，與細(xì)胞骨架和肌動(dòng)蛋白絲組裝動(dòng)力學(xué)相關(guān)的通路顯著富集。鑒于血影蛋白是紅細(xì)胞骨架的主要成分，作者推測(cè)血影蛋白可能是活化caspase-8的關(guān)鍵下游底物。而免疫印跡（WB）顯示補(bǔ)體激活紅細(xì)胞中的β-血影蛋白而非α-血影蛋白被切割。后面作者又通過(guò)caspase-8抑制劑預(yù)處理紅細(xì)胞證明了抑制劑可阻止β-血影蛋白的切割。為了證明caspase-8和β-血影蛋白之間的相互作用，用活性caspase-8孵育紅細(xì)胞影，發(fā)現(xiàn)β-血影蛋白被caspase-8有效切割。以上結(jié)果表明，NLRP3激活的caspase-8在補(bǔ)體誘導(dǎo)的紅細(xì)胞死亡過(guò)程中介導(dǎo)β-血影蛋白的切割。

由于β-血影蛋白的N端包含一個(gè)與絲狀肌動(dòng)蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，β-血影蛋白裂解會(huì)導(dǎo)致其與絲狀肌動(dòng)蛋白的解離，從而造成紅細(xì)胞細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)的破壞。而作者也證實(shí)了補(bǔ)體激活組紅細(xì)胞中β-血影蛋白與絲狀肌動(dòng)蛋白的共定位率顯著低于對(duì)照組。用caspase-8抑制劑可顯著恢復(fù)紅細(xì)胞中的β-血影蛋白和絲狀肌動(dòng)蛋白的紊亂狀態(tài)。同時(shí)，作者觀察到caspase-8孵育的紅細(xì)胞膜提取物的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，與補(bǔ)體處理后的變化相似。這些發(fā)現(xiàn)表明，β-血影蛋白的切割可直接導(dǎo)致紅細(xì)胞膜完整性的喪失。

圖5. NLRP3激活caspase-8引發(fā)紅細(xì)胞中的β-血影蛋白裂解導(dǎo)致細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)破壞

（圖片源自《Cell》）

作者進(jìn)一步在已建立的急性溶血性輸血反應(yīng)（AHTR）小鼠模型中進(jìn)行了體內(nèi)抑制劑給藥實(shí)驗(yàn)。在輸注血漿前，小鼠分別接受了PBS、MCC950和Z-IETD-FMK的預(yù)處理。結(jié)果表明，MCC950和Z-IETD-FMK處理均能顯著減少血紅蛋白尿的排泄，表明溶血得到了緩解。同時(shí)游離HB水平明顯降低。此外，抑制劑處理顯著提高了小鼠的生命力。與對(duì)照組相比，抑制劑處理組的棘形紅細(xì)胞II、球形紅細(xì)胞和影紅細(xì)胞的比例降低，而圓盤形紅細(xì)胞的比例增加。隨后，作者又通過(guò)使用能抑制補(bǔ)體系統(tǒng)的合成肽Cp40對(duì)小鼠進(jìn)行治療。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cp40的溶血治療效果和前面兩種抑制劑的效果相當(dāng)。作者進(jìn)一步同時(shí)用MCC950和Cp40進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥效果比單獨(dú)Cp40效果更佳。表明聯(lián)合用藥有顯著的治療潛力，阻斷補(bǔ)體旁路途徑和抑制補(bǔ)體活性有望用于治療補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血。

圖6. 阻斷補(bǔ)體激活信號(hào)可以減輕補(bǔ)體誘導(dǎo)的溶血

（圖片源自《Cell》）

本研究揭示了成熟紅細(xì)胞中的一種由β-血影蛋白控制的程序性死亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，為補(bǔ)體誘導(dǎo)的溶血相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路提供了進(jìn)一步見解，這對(duì)溶血性疾病的治療具有重要意義。

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