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腫瘤對(duì)嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）等過(guò)繼細(xì)胞免疫療法（ACTs）的耐藥性是臨床上的一個(gè)主要挑戰(zhàn)，盡管ACTs在腫瘤治療中取得了巨大成功，但大部分的病人在治療中仍然會(huì)失敗，主要原因就是ACTs的耐藥性，如有限的T細(xì)胞浸潤(rùn)、腫瘤細(xì)胞逃避T細(xì)胞識(shí)別和凋亡的能力、T細(xì)胞功能障礙。EZH2是一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，介導(dǎo)H3K27me3并驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄沉默，且在多種液體和實(shí)體瘤大量表達(dá)，EZH1是EZH2的功能同源物。在這項(xiàng)研究中，評(píng)估了EZH2和EZH1/ EZH2雙重抑制對(duì)血液和實(shí)體腫瘤模型中CAR-T和TCR-T細(xì)胞治療的影響，相關(guān)研究成果發(fā)表于《Cancer Cell》。

1. EZH2抑制使淋巴瘤細(xì)胞對(duì)CART19治療敏感

首先探索tazemetostat（Taz）抑制EZH2增強(qiáng)CART19（抗CD19嵌合抗原受體T細(xì)胞）免疫治療的潛力，因?yàn)檫@種治療方法批準(zhǔn)用于依賴EZH2的GC B型淋巴瘤，所以研究團(tuán)隊(duì)選擇了四種彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）細(xì)胞系（野生型EZH2：OCI-Ly18和Toledo，突變型EZH2：SU-DHL-4和Karpas-422）。實(shí)驗(yàn)中使用次優(yōu)劑量的Taz敲除H3K27三甲基化且不影響短期內(nèi)細(xì)胞的存活和增殖，以此來(lái)評(píng)估Taz聯(lián)合CART19（CART19-Taz）的治療潛力，隨后，在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)CART19-Taz可以顯著提高CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤療效。

圖1. Taz聯(lián)合CART19顯著提高CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤療效

圖片源于《Cancer Cell》

2. EZH2抑制重塑腫瘤的免疫原性

那么，EZH2抑制是如何增強(qiáng)CAR-T治療效果的呢？發(fā)現(xiàn)暴露于CART19-Taz的腫瘤細(xì)胞特異性上調(diào)了相關(guān)基因，包括：炎癥（IL2RA）、B細(xì)胞活化/分化（如KDM5B、BACH2）、粘附（如TNFSF4、CD80）、T細(xì)胞趨化因子（如CXCL9、CXCL10、CXCL16）和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)（如LMNA、CEACAM1、NRCAM、EPHB2）。進(jìn)一步探索EZH2抑制在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中對(duì)CART19免疫療法的影響，發(fā)現(xiàn)CART19治療組腫瘤體積明顯變小，并將腫瘤組織用于病理和基因表達(dá)分析。病理結(jié)果顯示CART19-Taz組腫瘤組織中觀察到更小、更多的壞死腫瘤且T細(xì)胞浸潤(rùn)顯著增加。差異表達(dá)基因熱圖結(jié)果顯示，EZH2抑制可顯著上調(diào)MHC-I/II抗原（HLA-A、HLA-DOA、HLA-DOB）、共刺激分子（CXCL9、CXCL10、CD40）、黏附分子（ICAM1）、B細(xì)胞活化標(biāo)志（FOS、JUN）、干擾素（IFN）應(yīng)答通路（STAT1-3、IRF2/7/9）和p53介導(dǎo)的凋亡相關(guān)基因（FAS、ATF3、CASP3/4/7、MCL1、MDM2）。以上結(jié)果表明，EZH2抑制重塑腫瘤的免疫原性，調(diào)節(jié)炎癥和凋亡途徑。隨后評(píng)估CART19細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的親和力，發(fā)現(xiàn)Taz預(yù)處理顯著增強(qiáng)了CART19細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的親和力，表明腫瘤細(xì)胞與CAR-T細(xì)胞的結(jié)合效率增強(qiáng)，EZH2抑制增強(qiáng)了腫瘤與CAR-T細(xì)胞的相互作用。

圖2. EZH2抑制增強(qiáng)腫瘤的免疫原性

圖片源于《Cancer Cell》

3. EZH2抑制增強(qiáng)CART19細(xì)胞的細(xì)胞毒性

研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步探究了EZH2抑制對(duì)CAR-T細(xì)胞的影響。體外實(shí)驗(yàn)顯示，與經(jīng)Taz預(yù)處理的腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，該藥物能顯著增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌（IFN-γ、TNF和IL-2），提升長(zhǎng)期殺傷能力，并促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)增。流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步證實(shí)經(jīng)Taz處理的CART19細(xì)胞中效應(yīng)記憶T細(xì)胞亞群比例增加。為評(píng)估CAR-T細(xì)胞的持續(xù)功能，進(jìn)行了再攻擊實(shí)驗(yàn)：將CART19細(xì)胞與經(jīng)Taz預(yù)處理或未處理的SU-DHL-4細(xì)胞共培養(yǎng)，并分別在4天、7天和11天時(shí)重新引入未處理的腫瘤細(xì)胞以誘導(dǎo)CAR-T細(xì)胞功能衰竭，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Taz聯(lián)用的CART19細(xì)胞相較于單獨(dú)的CART19細(xì)胞，能持續(xù)保持更強(qiáng)的細(xì)胞毒性和擴(kuò)增能力，且后者呈現(xiàn)殺傷效能下降和增殖減弱的現(xiàn)象。進(jìn)一步研究體內(nèi)腫瘤浸潤(rùn)性CART19細(xì)胞的特性，Taz處理組腫瘤中的CART19細(xì)胞進(jìn)行基因集富集分析（GSEA）顯示，相較于對(duì)照組，這些細(xì)胞的激活與細(xì)胞毒性相關(guān)基因（如GZMB、PRF1、IFNG和CD69）表達(dá)上調(diào)，而耗竭標(biāo)志物（如LAIR2）表達(dá)下調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)表明，EZH2抑制增強(qiáng)了T細(xì)胞的浸潤(rùn)，并促進(jìn)了腫瘤內(nèi)CART19細(xì)胞的腫瘤反應(yīng)性和細(xì)胞毒性。為了進(jìn)一步研究EZH2抑制對(duì)血液中CART19細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)CART19-Taz治療能改善腫瘤控制并延長(zhǎng)生存期。此外，當(dāng)SU-DHL-4細(xì)胞預(yù)先Taz處理，再暴露于野生型或EZH2敲除的CART19細(xì)胞時(shí)，Taz仍能增強(qiáng)兩組細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。這些研究結(jié)果表明，Taz通過(guò)抑制EZH2重塑腫瘤細(xì)胞的免疫原性，從而促進(jìn)CART19細(xì)胞更有效的活化，并保持CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)。

圖3. EZH2抑制增強(qiáng)CART19細(xì)胞的細(xì)胞毒性

圖片源于《Cancer Cell》

4. EZH2及EZH1/EZH2雙重抑制顯著增強(qiáng)基于CAR-T和TCR-T細(xì)胞的免疫療法對(duì)多種血液腫瘤和實(shí)體瘤的抗腫瘤療效

接下來(lái)，研究團(tuán)隊(duì)試圖研究CAR-T免疫治療在液體和實(shí)體癌癥中的作用。首先針對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤開發(fā)了靶向CD22和CD79b的CAR-T細(xì)胞療法——鑒于B細(xì)胞惡性腫瘤治療中迫切需要解決耐藥性和抗原逃逸問(wèn)題的替代靶點(diǎn)，值得注意的是，EZH2抑制在這些模型中顯著增強(qiáng)了CAR-T細(xì)胞的殺傷效果。在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中，證實(shí)EZH2抑制具有廣泛增強(qiáng)CAR-T療法對(duì)血液惡性腫瘤療效的潛力。進(jìn)一步研究EZH2抑制在實(shí)體瘤（如HER2⁺卵巢癌、前列腺癌及肉瘤）中的聯(lián)合治療效果，觀察到Taz聯(lián)合CAR-T細(xì)胞的長(zhǎng)期殺傷作用顯著增強(qiáng)，并將此擴(kuò)展到上皮樣肉瘤，發(fā)現(xiàn)Taz顯著提高TCR-T細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用。以上數(shù)據(jù)表明，EZH2抑制劑對(duì)多種實(shí)體瘤及各類過(guò)繼性T細(xì)胞免疫療法均具有廣闊的應(yīng)用前景。隨后提出假設(shè)：由于EZH2被抑制時(shí)EZH1的代償作用及其在非增殖細(xì)胞中的表達(dá)特性，聯(lián)合抑制EZH1與EZH2可能會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)CAR-T療效。發(fā)現(xiàn)EZH1/EZH2雙重抑制劑（valemetostat，VAL）確實(shí)可以顯著提升CART19的腫瘤殺傷效力，隨后通過(guò)再攻擊實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)VAL處理的CART19細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)更持久殺傷能力。進(jìn)一步在RPMI-8226骨內(nèi)原位移植瘤模型中證實(shí)VAL可增強(qiáng)靶向BCMA（B細(xì)胞成熟抗原）的CAR-T細(xì)胞的腫瘤控制效果，促進(jìn)外周血T細(xì)胞擴(kuò)增，且其血清中細(xì)胞毒性細(xì)胞因子IFN-γ水平升高，表明T細(xì)胞的活化程度及細(xì)胞毒性反應(yīng)增強(qiáng)。

圖4. EZH2以及EZH1/EZH2抑制增強(qiáng)血液腫瘤和實(shí)體瘤模型的免疫治療效果

云克隆開發(fā)了上述研究中涉及的相關(guān)指標(biāo)的蛋白、抗體、試劑盒等產(chǎn)品以助力相關(guān)研究，部分指標(biāo)節(jié)選如下，供參考：