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維持葡萄糖和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)對(duì)健康至關(guān)重要，其失調(diào)會(huì)導(dǎo)致諸如2型糖尿病（T2DM）和代謝功能障礙相關(guān)的脂肪性肝?。∕AFLD）等代謝疾病。RNA結(jié)合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）在多種RNA加工活動(dòng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。越來越多的證據(jù)表明，某些RBPs在調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用，從而影響代謝性疾病的發(fā)病機(jī)制。然而，RBPs在葡萄糖和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的綜合調(diào)節(jié)中作為代謝性疾病關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素的潛力仍未得以全面探索。本研究發(fā)現(xiàn)烷基化修復(fù)同源蛋白5（ALKBH5）是代謝性疾病的主要調(diào)節(jié)因子。肝細(xì)胞特異性缺失Alkbh5通過抑制胰高血糖素受體（GCGR）和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1（mTORC1）信號(hào)通路來降低葡萄糖和脂質(zhì)。靶向敲低肝臟Alkbh5可逆轉(zhuǎn)糖尿病小鼠的T2DM和MAFLD，突出其治療潛力。

圖1. 肝臟中ALKBH5調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)

（圖片源自《Science》）

db/db BKS小鼠是代謝性疾?。òǚ逝职Y、T2DM、MAFLD和高脂血癥）研究中廣泛使用的模型。為了鑒定db/db小鼠肝臟中差異表達(dá)的RNA結(jié)合蛋白（RBPs），作者對(duì)其進(jìn)行了定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析。發(fā)現(xiàn)了7個(gè)上調(diào)表達(dá)的RBPs，其中兩個(gè)含有與調(diào)控肝臟糖異生相關(guān)的RRXS/T基序。結(jié)合已發(fā)表的大小鼠肝臟中磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集綜合分析發(fā)現(xiàn)，只有上調(diào)的ALKBH5，一種關(guān)鍵的RNAN⁶-甲基腺苷（m⁶A）去甲基化酶屬于RBPs。

WB結(jié)果證實(shí)，db/db小鼠、高脂飲食（HFD）誘導(dǎo)的肥胖小鼠以及人類糖尿病肝臟中ALKBH5蛋白表達(dá)量和正常對(duì)照相比顯著升高。后續(xù)作者就把研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向ALKBH5。他們分析發(fā)現(xiàn)ALKBH5中有兩個(gè)RRXS基序，包含Ser²⁵³和Ser³⁶²。然而，肝臟和肝細(xì)胞樣本的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)中僅檢測(cè)到Ser³⁶²的磷酸化，這表明Ser³⁶²是ALKBH5發(fā)揮作用的關(guān)鍵。由于ALKBH5在肝臟中的表達(dá)量高于其他代謝組織。這些信息表明，ALKBH5可能調(diào)節(jié)肝臟的葡萄糖和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)。

隨后，作者利用CRISPR/Cas9技術(shù)生成了S362A點(diǎn)突變小鼠來研究Ser³⁶²磷酸化是否對(duì)ALKBH5增強(qiáng)肝葡萄糖生成（HGP）的作用至關(guān)重要。作者發(fā)現(xiàn)雖然S362A小鼠和WT小鼠體重相當(dāng)，但S362A小鼠的空腹血糖水平較低，并且對(duì)HFD誘導(dǎo)的高血糖具有保護(hù)作用。此外，S362A小鼠的葡萄糖耐量得到改善，并且對(duì)HFD誘導(dǎo)的葡萄糖耐受不良具有保護(hù)作用。在正常飼料（NC）飲食和HFD條件下，S362A小鼠的曲線下面積（Area Under Curve，AUC）均降低。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了ALKBH5作為肝葡萄糖生成的正向調(diào)節(jié)因子的作用，突出了Ser³⁶²磷酸化在其調(diào)節(jié)功能中的重要性。

圖2. 定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析確定ALKBH5是代謝疾病的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子

（圖片源自《Science》）

為了探究肝臟中ALKBH5在代謝調(diào)節(jié)和疾病中的作用，作者構(gòu)建了肝細(xì)胞特異性Alkbh5基因敲除小鼠（Alkbh5-HKO）用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。作者將研究重點(diǎn)放在了胰高血糖素-GCGR-cAMP-PKA-CREB信號(hào)通路上。雄性Alkbh5^flox/flox小鼠和Alkbh5-HKO小鼠的血清胰島素水平相似。然而，在NC和HFD條件下，Alkbh5-HKO小鼠肝臟中的GCGR、cGMP、磷酸化PKA（p-PKA）底物以及磷酸化CREB（p-CREB）水平均降低。此外，Gcgr和糖異生相關(guān)的基因在Alkbh5-HKO小鼠肝臟中的表達(dá)量均有所下降。同樣，S362A突變削弱了GCGR-cAMP-PKA-CREB信號(hào)通路，并降低了S362A小鼠中糖異生相關(guān)基因的表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)表明，ALKBH5及其在Ser³⁶²位點(diǎn)的磷酸化在維持GCGR-cAMP-PKA-CREB信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用。

隨后，為了明確GCGR減少在Alkbh5-HKO小鼠中的降糖作用，作者進(jìn)行了挽救實(shí)驗(yàn)。在Alkbh5-HKO小鼠中恢復(fù)GCGR表達(dá)后，小鼠中血糖水平升高，葡萄糖耐受量、乳酸誘導(dǎo)的肝糖生成增加，以及胰高血糖素敏感性增強(qiáng)。而這種逆轉(zhuǎn)歸因于Alkbh5-HKO小鼠中GCGR-cAMP-PKA-CREB信號(hào)通路的激活以及糖異生相關(guān)基因的表達(dá)量上調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明，ALKBH5對(duì)葡萄糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)作用是通過GCGR來介導(dǎo)的。

圖3. ALKBH5通過GCGR調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)

（圖片源自《Science》）

接下來，作者研究了ALKBH5影響GCGR調(diào)控的分子機(jī)制。通過m⁶A–RNA免疫沉淀測(cè)序（MeRIP-seq）和RNA測(cè)序（RNA-seq）分析，作者發(fā)現(xiàn)Alkbh5-HKO小鼠肝臟中Gcgr轉(zhuǎn)錄本的m⁶A修飾增加，同時(shí)Gcgr mRNA減少。這表明ALKBH5可能通過其去甲基化酶活性增強(qiáng)Gcgr的表達(dá)。作者隨后構(gòu)建了一個(gè)具有去甲基化酶失活突變（H205A）的ALKBH5突變體，并使用腺病毒進(jìn)行功能檢測(cè)，證實(shí)ALKBH5而非ALKBH5（H205A）能夠恢復(fù)雄性Alkbh5-HKO小鼠肝臟中Gcgr、其下游信號(hào)通路以及糖異生相關(guān)基因（G6pase和Pepck）的減少。因此，ALKBH5而非ALKBH5（H205A）能夠恢復(fù)葡萄糖穩(wěn)態(tài)表型，包括血糖、葡萄糖耐量、乳酸誘導(dǎo)的葡萄糖生成以及胰高血糖素敏感性。作者又測(cè)量了Gcgr mRNA的穩(wěn)定性。Alkbh5的缺失降低了原代肝細(xì)胞中Gcgr mRNA的穩(wěn)定性，而野生型ALKBH5而非ALKBH5（H205A）增強(qiáng)了Gcgr mRNA的穩(wěn)定性。這些證據(jù)強(qiáng)調(diào)了ALKBH5的去甲基化功能在調(diào)節(jié)Gcgr表達(dá)和穩(wěn)定性方面的作用，從而影響葡萄糖代謝和胰高血糖素敏感性。

核糖核蛋白免疫沉淀（RIP）-RT-qPCR分析表明，ALKBH5直接與Gcgr轉(zhuǎn)錄本的m⁶A修飾區(qū)域相互作用。隨后，作者研究了Gcgr轉(zhuǎn)錄本m⁶A區(qū)域內(nèi)的GGACU基序?qū)τ贏LKBH5調(diào)節(jié)作用的重要性。通過將該基序替換為GGCCU（命名為Gcgr-m⁶A Mut），發(fā)現(xiàn)ALKBH5以劑量依賴的方式增強(qiáng)了WT Gcgr-m⁶A構(gòu)建體的熒光素酶活性，但對(duì)突變體構(gòu)建體的活性沒有影響。敲低Mettl3也能增加WT Gcgr-m⁶A構(gòu)建體的熒光素酶活性。這些結(jié)果表明，ALKBH5通過調(diào)節(jié)Gcgr mRNA的m⁶A修飾和穩(wěn)定性來調(diào)控葡萄糖穩(wěn)態(tài)。

圖4. ALKBH5通過其去甲基化活性促進(jìn)Gcgr mRNA的穩(wěn)定

（圖片源自《Science》）

肝臟葡萄糖代謝與脂質(zhì)代謝之間的相互關(guān)系促使作者對(duì)Alkbh5^flox/flox和Alkbh5-HKO小鼠的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)進(jìn)行了評(píng)估。在正常飲食條件下，兩組小鼠的肝臟甘油三酯（TAG）水平相似。然而，在HFD條件下，雄性和雌性Alkbh5-HKO小鼠均表現(xiàn)出HFD誘導(dǎo)的MAFLD和高脂血癥減輕。這種保護(hù)作用體現(xiàn)在肝臟TAG水平降低、S13A、脂滴減少、血清TAG和總膽固醇（TC）水平降低、血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）活性降低以及慢性炎癥因子（Tnfa，Ccl2，Il1a，Il1b，Il6，Ifng和Ccl5）表達(dá)降低。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明，肝細(xì)胞特異性缺失Alkbh5不僅改善了葡萄糖穩(wěn)態(tài)，還預(yù)防了HFD誘導(dǎo)的MAFLD和高脂血癥。

圖5. 肝細(xì)胞特異性缺失Alkbh5可預(yù)防HFD誘導(dǎo)的脂肪變性及高脂血癥

（圖片源自《Science》）

為了探究ALKBH5在脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)中的功能是否由EGFR介導(dǎo)，作者進(jìn)行了EGFR挽救實(shí)驗(yàn)。通過Ad-EGFR腺病毒在從Alkbh5-HKO小鼠分離出的原代肝細(xì)胞中恢復(fù)EGFR表達(dá)，使p-EGFR、p-PI3Kp55、p-AKT、p-mTOR、p-ULK1、p-S6K、成熟的SREBP1、CD36、FASN和SCD1的水平得以恢復(fù)。同樣，在雄性Alkbh5-HKO小鼠肝臟中恢復(fù)EGFR表達(dá)，抵消了這些信號(hào)分子的減少以及LC3II/LC3I比值的升高，從而導(dǎo)致了ALKBH5過表達(dá)還提高了EGFR水平，隨后增加了EGFR-PI3K-AKT-mTORC1信號(hào)通路成分的磷酸化以及成熟的SREBP1、CD36、FASN和SCD1的量。EGFR抑制劑拉帕替尼能有效地阻斷ALKBH5誘導(dǎo)的這些信號(hào)通路的激活。這些結(jié)果表明，ALKBH5通過EGFR-PI3K-AKT-mTORC1信號(hào)通路影響MAFLD。

圖6. ALKBH5通過EGFR-PI3K-AKTmTORC1信號(hào)通路調(diào)節(jié)MAFLD

（圖片源自《Science》）

作者發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞特異性敲除Alkbh5可改善葡萄糖和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，這表明ALKBH5是治療代謝性疾病的一個(gè)很有前景的靶點(diǎn)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證抑制肝臟ALKBH5的治療效果，作者使用N-乙酰氨基半乳糖（GalNAc）偶聯(lián)的修飾型siRNA來沉默db/db小鼠肝臟中的Alkbh5基因。GalNAc-siAlkbh5能夠有效且特異性地降低db/db小鼠肝臟中ALKBH5的水平。盡管這兩組小鼠的體重相似，但通過GalNAc-siAlkbh5敲低db/db小鼠肝臟中的Alkbh5基因，其空腹血糖水平降低，血清胰島素水平降低，葡萄糖耐量得到改善，肝臟葡萄糖生成減少，胰高血糖素敏感性降低，這可能是由于GCGR-cAMP-PKA-CREB信號(hào)通路的下調(diào)以及與糖異生相關(guān)的基因表達(dá)降低。此外，通過GalNAc-siAlkbh5敲低db/db小鼠肝臟中的Alkbh5基因，還改善了MAFLD。這些研究結(jié)果共同表明，在db/db小鼠中通過RNAi技術(shù)介導(dǎo)的肝臟Alkbh5敲低，能夠有效逆轉(zhuǎn)T2DM和MAFLD，其機(jī)制在于抑制了GCGR-cAMP-CREB和EGFR-PI3K-mTORC1信號(hào)通路。

圖7. 肝臟特異性敲低Alkbh5可逆轉(zhuǎn)db/db小鼠的T2DM、MAFLD和高脂血癥。

（圖片源自《Science》）

本研究結(jié)果表明，ALKBH5通過影響GCGR和mTORC1通路，為T2DM和MAFLD提供了一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。另外，RBPs可以被策略性地操控用于治療目的，以對(duì)抗代謝疾病。

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