星形膠質(zhì)細(xì)胞LRP1通過抑制ARF1乳酸化緩解腦缺血中風(fēng)

急性腦缺血中風(fēng)是全世界發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一,可造成毀滅性和永久性的神經(jīng)損傷。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,星形膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元細(xì)胞間的線粒體傳遞對于維持神經(jīng)元細(xì)胞的有氧呼吸和能量供給具有重要的意義。低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-1(Low density lipoprotein receptor related protein-1,LRP1)是一種內(nèi)吞/信號細(xì)胞表面受體,調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能。前期研究表明,LRP1與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān),但其在大腦中的確切功能尚未有統(tǒng)一定論。因此,LRP1是否參與維持大腦穩(wěn)態(tài)以及如何發(fā)揮作用還有待明確。最近,西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院在《Cell Metabolism》上發(fā)表了題為“Astrocytic LRP1 enables mitochondria transfer to neurons and mitigates brain ischemic stroke by suppressing ARF1 lactylation”的文章,研究報道了星形膠質(zhì)細(xì)胞LRP1通過減少乳酸的產(chǎn)生和囊泡運輸?shù)鞍譇DP核糖基化因子1(ADP ribosylation factor 1,ARF1)的乳酸化來促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞到神經(jīng)元的線粒體轉(zhuǎn)移,這一過程可以拮抗缺血所造成的器官損傷。


作者首先證明了星形膠質(zhì)細(xì)胞可以釋放健康的線粒體并將其轉(zhuǎn)移到鄰近的神經(jīng)元。隨后,為了檢驗星形膠質(zhì)細(xì)胞LRP1是否影響線粒體的釋放和轉(zhuǎn)移,研究者敲低了小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中的Lrp1基因,在新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后收集星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基(Astrocyte-conditioned medium,ACM)。與對照組相比,Lrp1基因敲低減少了細(xì)胞外線粒體的數(shù)量,并伴有線粒體功能下降,包括耗氧量和ATP產(chǎn)生減少。接下來,研究者從mitoSypHer標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞中分離細(xì)胞外線粒體,并將其添加到小鼠HT22海馬神經(jīng)元中。熒光顯微觀察證實,與對照組相比,Lrp1缺失的ACM細(xì)胞外線粒體處理的神經(jīng)元中mitoSypHer標(biāo)記的線粒體較少,這表明Lrp1敲除減少了線粒體向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)移。此外,在神經(jīng)元-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)24h后,在對照神經(jīng)元中觀察到更多的線粒體,而在與Lrp1缺失的星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的神經(jīng)元中則沒有。由此可見,星形膠質(zhì)細(xì)胞中Lrp1的缺失降低了共培養(yǎng)神經(jīng)元的線粒體ATP生成和氧消耗率(OCR)。總的來說,這些結(jié)果表明星形膠質(zhì)細(xì)胞LRP1促進(jìn)線粒體從星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到鄰近的神經(jīng)元。

圖1. 星形膠質(zhì)細(xì)胞LRP1促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞到神經(jīng)元的線粒體轉(zhuǎn)移

(圖片來自《Cell Metabolism》)

 

線粒體在細(xì)胞能量代謝中起核心作用。為了探索LRP1介導(dǎo)的線粒體轉(zhuǎn)移的代謝機(jī)制,研究者們對表達(dá)shCtrl或shLrp1的星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了靶向代謝組學(xué)分析。結(jié)果觀察到,在Lrp1缺失的星形膠質(zhì)細(xì)胞中,細(xì)胞內(nèi)葡萄糖和糖酵解中間體甘油醛3-磷酸和乳酸增加。隨著糖酵解和三羧酸循環(huán)(TCA)代謝物的積累,與shCtrl組相比,shLrp1組星形膠質(zhì)細(xì)胞的OCR和細(xì)胞外酸化率(ECAR)均升高。此外,Lrp1敲低的星形膠質(zhì)細(xì)胞的ECAR/OCR比率和ATP生成速率也顯著增加,表明糖酵解相對于氧化磷酸化增強(qiáng)。

接下來,研究者通過13C示蹤實驗進(jìn)一步研究Lrp1基因敲低星形膠質(zhì)細(xì)胞乳酸水平升高的原因。分別用[U-13C]葡萄糖、[U-13C]L-谷氨酰胺或[U-13C]乙酸標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞,并分析了13C隨后整合到乳酸和TCA循環(huán)代謝產(chǎn)物中的情況。結(jié)果表明,大部分乳酸是由葡萄糖產(chǎn)生的,Lrp1敲低增加了星形膠質(zhì)細(xì)胞中乳酸的產(chǎn)生。這些結(jié)果表明星形膠質(zhì)細(xì)胞Lrp1敲低通過糖酵解產(chǎn)生更多的乳酸。

圖2. Lrp1敲低促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的糖酵解和乳酸代謝

(圖片來自《Cell Metabolism》)

 

隨著乳酸的增加,研究者觀察到接受shLrp1治療的星形膠質(zhì)細(xì)胞中整體蛋白賴氨酸乳酸化(Kla)水平升高。為了測試ARF1-Kla73是否是線粒體釋放的關(guān)鍵介質(zhì),將ARF1的Lys73突變?yōu)榫彼幔↘73R),從而阻止了乳酸化修飾。結(jié)果顯示,K73R轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中ARF1活性受到抑制,線粒體釋放上調(diào)。相比之下,K73突變?yōu)楣劝滨0罚↘73Q),模擬了乳酸化,導(dǎo)致ARF1的激活和線粒體釋放的進(jìn)一步抑制。這些發(fā)現(xiàn)表明乳酸通過ARF1-Kla73降低星形膠質(zhì)細(xì)胞的線粒體釋放。

圖3. ARF1-K73乳酸化介導(dǎo)lRP1誘導(dǎo)的線粒體釋放

(圖片來自《Cell Metabolism》)

 

接下來,作者驗證了LRP1誘導(dǎo)的線粒體轉(zhuǎn)移是否能保護(hù)腦缺血損傷。敲除C57BL/6J雄性小鼠星形細(xì)胞中的Lrp1。結(jié)果表明,Lrp1條件敲低(cKD)小鼠表現(xiàn)出大腦中葡萄糖攝取增加和乳酸水平升高,從而導(dǎo)致腦脊液(CSF)中星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體減少。通過共聚焦顯微鏡和活體雙光子成像證實,Lrp1敲低導(dǎo)致神經(jīng)元中星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的線粒體減少。大腦中動脈閉塞(MCAO)手術(shù)后,Lrp1 cKD小鼠腦梗死區(qū)域明顯增大,提示LRP1對腦缺血損傷具有保護(hù)作用。此外,通過改進(jìn)的Bederson神經(jīng)評分,水迷宮和曠場測試發(fā)現(xiàn),Lrp1 cKD小鼠表現(xiàn)出神經(jīng)功能惡化。這與邊緣區(qū)神經(jīng)元中星形膠質(zhì)細(xì)胞來源細(xì)胞內(nèi)線粒體減少的結(jié)果一致。這一結(jié)果強(qiáng)調(diào)了星形膠質(zhì)細(xì)胞在應(yīng)激條件下保持大腦穩(wěn)態(tài)的潛在作用。

圖4. LRP1調(diào)控的星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體轉(zhuǎn)移減輕腦缺血再灌注損傷

(圖片來自《Cell Metabolism》)

 

研究者進(jìn)一步測試了ARF1-K73乳酸化是否介導(dǎo)LRP1對腦I/R損傷的保護(hù)作用。將攜帶ARF1野生型(WT)、ARF1-K73R或ARF1-K73Q的2型腺相關(guān)病毒(AAV2)注射到星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性敲低Lrp1的C57BL/6J小鼠體內(nèi)。與接受ARF1-WT的Lrp1 cKD小鼠相比,接受ARF1-K73R的小鼠在CSF和神經(jīng)元中表現(xiàn)出更多的星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的線粒體。這表明在缺乏Lrp1的情況下,減少ARF1乳酸化會增加星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體釋放。用MCAO誘導(dǎo)這些小鼠I/R損傷,以評估ARF1-K73R和ARF1-K73Q在腦損傷中的作用。與ARF1-WT治療的Lrp1 cKD小鼠相比,接受ARF1-K73R治療的小鼠梗死面積減少,神經(jīng)功能改善,邊緣區(qū)神經(jīng)元中星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的線粒體增加。這表明,星形膠質(zhì)細(xì)胞ARF1乳酸化減少線粒體轉(zhuǎn)移,加重腦I/R損傷。隨后,研究者又量化了人類卒中患者和正常受試者的CSF乳酸水平。與正常對照相比,缺血性腦卒中患者CSF乳酸水平顯著升高,乳酸水平與梗死面積呈正相關(guān),與CSF星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體呈負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果支持了乳酸降低線粒體轉(zhuǎn)移并加重腦I/R損傷的結(jié)論。

圖5. 星形膠質(zhì)細(xì)胞ARF1-K73乳酸化降低線粒體轉(zhuǎn)移加重腦I/R損傷

(圖片來自《Cell Metabolism》)

 

本研究揭示了LRP1通過調(diào)節(jié)健康線粒體從星形膠質(zhì)細(xì)胞向受損神經(jīng)元的轉(zhuǎn)移發(fā)揮其在缺血性腦卒中中的保護(hù)作用。這為腦卒中和阿爾茲海默癥等神經(jīng)性相關(guān)疾病的研究提供了理論基礎(chǔ),也說明了靶向線粒體轉(zhuǎn)移的干預(yù)手段在疾病預(yù)防和治療中具有良好的應(yīng)用潛力。

云克隆開發(fā)了上述研究中相關(guān)指標(biāo)的蛋白、抗體和試劑盒產(chǎn)品,同時提供相關(guān)原代細(xì)胞和動物模型以助力科學(xué)研究,部分指標(biāo)如下,供您參考:

相關(guān)蛋白、抗體和試劑盒:

指標(biāo)名稱

核心貨號

指標(biāo)名稱

核心貨號

LRP1

B010

GLUT1

B185

AGL

D819

VEGF

A143

MCT1

H431

A551

FGF2

PANX1

E788

LDHA

D370

LDHB

B698

ATP

A349

 

相關(guān)原代細(xì)胞和動物模型:

貨號

細(xì)胞/模型名稱

CSI011Mu01

小鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞(BA)原代細(xì)胞

CSI011Ra01

大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞(BA)原代細(xì)胞

CSI011Rb01

兔腦星形膠質(zhì)細(xì)胞(BA)原代細(xì)胞

CSI011Ca01

犬腦星形膠質(zhì)細(xì)胞(BA)原代細(xì)胞

CSI099Mu01

小鼠腦干神經(jīng)元細(xì)胞(BSNC)原代細(xì)胞

CSI099Ra01

大鼠腦干神經(jīng)元細(xì)胞(BSNC)原代細(xì)胞

CSI099Rb01

兔腦干神經(jīng)元細(xì)胞(BSNC)原代細(xì)胞

CSI100Mu01

小鼠中腦神經(jīng)元細(xì)胞(MNC)原代細(xì)胞

CSI100Ra01

大鼠中腦神經(jīng)元細(xì)胞(MNC)原代細(xì)胞

CSI100Rb01

兔中腦神經(jīng)元細(xì)胞(MNC)原代細(xì)胞

CSI264Ca01

犬大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞(CCNC)原代細(xì)胞

DSI523Mu01

腦缺血(CI)小鼠模型

DSI523Ra01

腦缺血(CI)大鼠模型

DSI523Rb01

腦缺血(CI)兔模型



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