體外研究新法寶，類器官 ——如何跟體內(nèi)器官更類似？
來源于干細胞的類器官是模擬人類生理的重要模型，并應用于遺傳疾病、癌癥、再生醫(yī)學等研究中。但這類類器官不包含在體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和疾病中起重要作用的特化免疫細胞。而腸道免疫功能紊亂可導致各種病理改變，包括持續(xù)感染和自身免疫等。雖然來源于干細胞的腸道類器官可以模擬上皮細胞的分化和功能，但由于缺乏組織特異性免疫區(qū)室，它們在腸道病理學研究中受限。為了彌補這類缺陷，成人或誘導多能干細胞衍生的類器官已與血源性先天或適應性免疫細胞共培養(yǎng)。然而，這類模型依然沒有真正的成人組織駐留淋巴細胞室。
2024年8月14日，有研究團隊在《Nature》期刊上發(fā)表了題為“Human organoids with an autologous tissue-resident immune compartment”的文章，該研究通過上皮類器官和自體組織駐留記憶T（Autologous tissue-resident memory T，TRM）細胞的自組織形成人腸道免疫類器官（Intestinal immuno-organoids，IIOs），該研究結(jié)合IIOs和單細胞轉(zhuǎn)錄組學來研究癌癥靶向生物制品在患者中引發(fā)的腸道炎癥，發(fā)現(xiàn)炎癥與活化CD8+ T細胞群的出現(xiàn)有關，這些細胞逐漸獲得上皮內(nèi)和細胞毒性特征。研究人員通過IIOs將Rho通路確定為緩解免疫治療相關腸道炎癥的新靶點。
以下為研究團隊的整體研究思路。
一、通過上皮類器官與TRM細胞的自組織形成IIOs。
該研究通過在類器官中引入TRM細胞從而引入相關淋巴細胞，因為TRM細胞永久駐留在腸黏膜中，是抵御病原體的一線防御，且TRM細胞具有記憶特性。由于人TRM細胞在酶從組織中去除后生存能力較差，研究人員采用了無酶、基于支架的抓取方案來分離腸道免疫細胞。流式細胞術結(jié)果顯示分離的細胞表達與腸道相關的TRM細胞標志物（包括CD161和CD117），及與組織駐留和上皮細胞整合等相關的表面分子（CD69和CD103等）。研究者從人腸道樣本中生成類器官和TRM細胞，還從同一供體收集了對應的外周血單核細胞（PBMCs）。類器官建立后，與TRM細胞或PBMCs在三維細胞外基質(zhì)中結(jié)合。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：雖然PBMCs占據(jù)了細胞外基質(zhì)空間，但與上皮細胞沒有明顯的相互作用，但TRM細胞亞群浸潤類器官在沒有刺激的情況下整合在上皮屏障內(nèi)，類似于腸道內(nèi)上皮淋巴細胞（Intestinal intraepithelial lymphocytes，IELs）的行為。（見圖1）
圖1. 腸道來源的TRM細胞可動態(tài)整合到自體類器官中形成IIOs。
（文中所有圖片均來源于《Nature》雜志）
一、結(jié)合IIOs和單細胞轉(zhuǎn)錄組學來研究T細胞雙特異性抗體（Tcell-bispecific，TCBs）對患者腸道炎癥的影響。
為了了解TRM細胞和IELs在體外與腸上皮細胞整合的方式，該研究使用單細胞RNA測序分析了來自三種不同小腸樣本的IIO培養(yǎng)物。研究表明，單獨培養(yǎng)或在IIOs中培養(yǎng)的TRM細胞，與匹配的血源細胞不同，在轉(zhuǎn)錄組學上由以下因素定義：（1）缺乏淋巴結(jié)歸巢所需的受體（SELL、CCR7），（2）腸道歸巢和整合因子（ITGA1、CCR9、JAML）本質(zhì)上高表達，（3）完全缺乏細胞毒性顆粒（GZMB、GZMK、GNLY）。研究人員進一步追蹤了供體匹配的腸道TRM細胞和血液T細胞，結(jié)果顯示了兩個種群在形態(tài)和遷移行為上的顯著差異。血液T細胞大部分是靜態(tài)和圓形的，但TRM細胞則呈現(xiàn)出細長的形狀，并在上皮層和細胞外基質(zhì)內(nèi)動態(tài)遷移。（見圖2）
圖2. 組織駐留的轉(zhuǎn)錄組特征和遷移行為是TRM細胞上皮嵌入和IIOs形成的基礎
接下來，研究人員測試了TRM細胞和PBMCs之間的差異轉(zhuǎn)錄組和遷移行為是否會轉(zhuǎn)化為效應功能的差異，特別是研究了IIOs與癌癥免疫治療相關的臨床毒性及嚴重的腸道炎癥之間的關聯(lián)。研究人員選擇了solitomab（一種T細胞雙特異性抗體，抗CD3/EpCAM抗體），旨在通過上皮細胞粘附分子（EpCAM）將活化的T細胞與實體腫瘤交聯(lián)，從而在患者中誘導侵襲性非故意腸道炎癥。該研究用臨床相關濃度的EpCAM靶向TCBs處理IIOs。與PBMCs培養(yǎng)的類器官不同，檢測caspase 3/7發(fā)現(xiàn)IIOs在低至40 pg/ml的濃度下以TCB劑量依賴性的方式靶向，并且在處理后8小時即可靶向。進一步研究結(jié)果表明相對于非靶向?qū)φ眨琓CB處理誘導T和B細胞狀態(tài)的比例發(fā)生變化。在第4小時特別突出的是TH1樣CD4+T群體，特征是TNF和IFNG信號的快速誘導，隨著時間的推移而下調(diào)。在48小時，觀察到活化的CD8+ IEL群體的出現(xiàn)，表達與細胞毒性（如GZMB）、TCR信號傳導和T細胞遷移相關的基因。同時，出現(xiàn)了（表達MKI67的）循環(huán)CD4+T細胞群和活化的B細胞群，而調(diào)節(jié)性T細胞群減少。且通過流式細胞術檢測，發(fā)現(xiàn)scRNA-seq檢測到的關鍵基因表達變化與蛋白水平的變化一致。這些結(jié)果顯示IIO細胞異質(zhì)性動力學與從經(jīng)歷自發(fā)和免疫檢查點抑制劑（ICI）誘導的腸道炎癥的患者中觀察到的原始樣本具有驚人的相似性。這些相似之處表明IIOs可用于體外研究腸道炎癥。（見圖3）
圖3. IIOs再現(xiàn)了與TCBs相關的臨床腸道炎癥
三、探究Rho通路對IIOs模型中炎癥的影響。
鑒于TNF阻斷抗體在自身免疫性疾病治療中的有效性，以及在模型中TNF的早期誘導，研究人員研究了其在促進分化和激活中的作用。預測從IIOs中完全去除TNF將阻止TRM細胞活化。TCB治療后，在IIOs中使用阿達木單抗（adalimumab）對TNF進行抗體中和證實了這一預測，處理后顯著降低了TRM細胞中關鍵激活和分化標志物ICAM-1、4-1BB、CD25和Gzmb的表達。此外，在炎癥反應中上皮表達的趨化因子CCL2顯著降低。鑒于TRM細胞在細胞外基質(zhì)內(nèi)的快速運動，研究人員假設T細胞的運動可能與炎癥關聯(lián)。為了驗證這一假設，該研究使用ROCK1/2（Rho-associated protein kinase 1/2）抑制劑Y-27632來抑制TCB處理的IIOs細胞的運動。發(fā)現(xiàn)ROCK抑制比TNF阻斷更有效地減少了上皮細胞凋亡，同時抑制TRM細胞運動，并誘導T細胞激活標記物和細胞溶解分子，如perforin和Gzmb。細胞內(nèi)染色顯示TNF的誘導也被抑制，但總體T細胞活力不變。由此研究人員將Rho通路確定為緩解免疫治療相關腸道炎癥的新靶點。（見圖4）
圖4. 轉(zhuǎn)錄組學分析闡明TCB介導的炎癥背后的免疫動力學
綜上，該研究使用IIOs確定了通過Rho通路阻斷TRM細胞運動有助于抑制炎癥。由于IIOs重現(xiàn)了表型結(jié)果和介導它們的細胞間相互作用，由此推測，IIOs不僅可以幫助研究藥物誘導炎癥的的組織駐留免疫反應，還可以助力研究包括腫瘤發(fā)生、感染性和自身免疫性疾病下的組織駐留免疫反應。
云克隆開發(fā)了與該研究相關的靶標產(chǎn)品，部分指標節(jié)選如下：
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