神經(jīng)膠質(zhì)瘤突觸招募適應(yīng)性可塑性的機(jī)制

癌細(xì)胞通過操縱正常的生物學(xué)過程促使自身不斷增殖。神經(jīng)系統(tǒng)在癌癥調(diào)節(jié)中的作用越來越受到重視。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF(brain-derived neurotrophic factor)是大腦中神經(jīng)元突觸可塑性的關(guān)鍵介質(zhì),它對(duì)神經(jīng)元的形態(tài)和生理功能發(fā)揮至關(guān)重要,可促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)以及大腦神經(jīng)細(xì)胞突觸的形成和穩(wěn)定。

近期來自斯坦福大學(xué)神經(jīng)學(xué)科的研究者們?cè)凇禢ature》上發(fā)表了題為“Glioma synapses recruit mechanisms of adaptive plasticity”的文章,這一突破性的研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤通過BDNF使用神經(jīng)元活動(dòng),這一舉動(dòng)與健康腦細(xì)胞相同:BDNF由神經(jīng)元傳至腫瘤細(xì)胞,激發(fā)細(xì)胞內(nèi)部連鎖反應(yīng),助力腫瘤形成更加復(fù)雜和強(qiáng)大的突觸網(wǎng)絡(luò)。

由于小兒膠質(zhì)瘤惡性細(xì)胞中BDNF受體TrkB呈高表達(dá),但卻不表達(dá)BDNF,說明其中的BDNF來自于外部微環(huán)境。因此,研究者通過缺乏BDNF活性誘導(dǎo)表達(dá)的基因工程小鼠模型(Bdnf-TMKI)測(cè)試了神經(jīng)元活性調(diào)節(jié)的BDNF分泌到腫瘤微環(huán)境中的作用。研究者在Bdnf-TMKI小鼠的深層皮質(zhì)投射神經(jīng)元中表達(dá)興奮性藍(lán)光門控視蛋白通道rhodopsin-2(圖1a),以實(shí)現(xiàn)皮質(zhì)投射(谷氨酸能)神經(jīng)元活動(dòng)的光遺傳刺激。將患者來源的小兒膠質(zhì)瘤(DIPG)細(xì)胞異種移植到額葉皮層和皮層下白質(zhì)中,在移植5周后,用既定的方案(每天10分鐘,20Hz藍(lán)光刺激,30秒開/90秒關(guān)周期)刺激皮質(zhì)投射神經(jīng)元活動(dòng),持續(xù)1周。正如預(yù)期的,作者觀察到BDNF野生型小鼠在受刺激后膠質(zhì)瘤增殖增加。在缺乏BDNF活性調(diào)節(jié)的表達(dá)和分泌的Bdnf-TMKI小鼠中,皮質(zhì)投射神經(jīng)元活性調(diào)節(jié)對(duì)膠質(zhì)瘤增殖的影響明顯減弱(圖1b-d)。

鑒于以上結(jié)果,研究者接下來探討了神經(jīng)活性調(diào)節(jié)的BDNF對(duì)BDNF野生型和攜帶DIPG異種移植物Bdnf-TMKI小鼠的存活率影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),神經(jīng)元活動(dòng)調(diào)節(jié)的BDNF表達(dá)和分泌的喪失導(dǎo)致腦干中攜帶患者來源DIPG異種移植物的Bdnf-TMKI小鼠生存優(yōu)勢(shì)明顯增加(圖1e),這與活動(dòng)調(diào)節(jié)的BDNF信號(hào)在腦微環(huán)境中強(qiáng)烈影響膠質(zhì)瘤進(jìn)展的假設(shè)一致。

研究表明,BDNF通過TrkB(由NTRK2編碼)受體作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞,并且BDNF是兒童神經(jīng)膠質(zhì)瘤對(duì)其作出反應(yīng)的關(guān)鍵神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。因此,作者測(cè)試了遺傳或藥理學(xué)TrkB阻斷對(duì)小兒膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的影響。將小鼠與患者來源的細(xì)胞原位異種移植。與移植了NTRK2野生型細(xì)胞的對(duì)照組相比,移植了腦干NTRK2-KO DIPG或額葉皮層NTRK2-KO兒科皮質(zhì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的小鼠的總體存活率顯著增加(圖1f)。使用抑制劑治療侵襲性患者源性小兒膠質(zhì)瘤(DIPG)原位異種移植模型可提高總生存率(圖1g)。說明抑制劑對(duì)DIPG的作用機(jī)制是通過TrkB介導(dǎo)的。

后期作者通過將神經(jīng)元與NTRK2野生型或NTRK2-KO膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)來研究BDNF-TrkB信號(hào)傳導(dǎo)在神經(jīng)元-膠質(zhì)瘤相互作用中的相對(duì)貢獻(xiàn)。結(jié)果表明,在缺乏神經(jīng)元的情況下,TrkB損失并不會(huì)降低小兒膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖(圖1i)。與神經(jīng)元共培養(yǎng)相比,BDNF配體單獨(dú)作用下TrkB損失引起的膠質(zhì)瘤增殖變化的程度(圖1h,i)。表明BDNF在神經(jīng)元-膠質(zhì)瘤相互作用中可能具有更復(fù)雜的作用,而不僅僅是作為一種活性調(diào)節(jié)的生長(zhǎng)因子。

在兒童和成人膠質(zhì)瘤中,谷氨酸能神經(jīng)元到膠質(zhì)瘤突觸是由鈣滲透性AMPARs介導(dǎo)的,并能有效調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展。在健康的大腦中,BDNF-TrkB信號(hào)通過多個(gè)機(jī)制調(diào)節(jié)谷氨酸能突觸傳遞。接著作者探索了BDNF-TrkB信號(hào)在膠質(zhì)瘤中的促生長(zhǎng)作用是否涉及突觸生物學(xué)調(diào)節(jié)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),藥物阻斷AMPARs或通過敲除NTRK2基因阻斷TrkB可降低體內(nèi)或神經(jīng)元-膠質(zhì)瘤共培養(yǎng)中腫瘤細(xì)胞的增殖(圖1j-m)。然而,沒有發(fā)現(xiàn)阻斷AMPARs和TrkB的疊加效應(yīng),這表明兩者之間存在機(jī)制相關(guān)性。


圖1. 神經(jīng)活動(dòng)調(diào)節(jié)的BDNF促進(jìn)膠質(zhì)瘤進(jìn)展

(圖片源自《Nature》)


研究者在急性切片制備中對(duì)移植到海馬的膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行了全細(xì)胞膜片鉗電生理實(shí)驗(yàn)(圖2a)。發(fā)現(xiàn)在切片上灌注BDNF增加了谷氨酸誘發(fā)電流的振幅(圖2b,c)。證實(shí)膠質(zhì)瘤細(xì)胞TrkB激活介導(dǎo)谷氨酸誘發(fā)電流振幅的變化。與NTRK2野生型膠質(zhì)瘤異種移植細(xì)胞相比,NTRK2敲除阻止了BDNF誘導(dǎo)的谷氨酸誘發(fā)內(nèi)向電流振幅的增加(圖2b,c),與BDNF通過CAMKII鈣信號(hào)通路調(diào)節(jié)突觸強(qiáng)度的假設(shè)一致,CAMKII抑制劑KN-93阻斷了BDNF對(duì)膠質(zhì)瘤谷氨酸能電流振幅的影響,而非活性類似物KN-92則沒有(圖2d,e)。這些發(fā)現(xiàn)表明BDNF-TrkB信號(hào)通路調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中谷氨酸誘發(fā)電流的強(qiáng)度。

膠質(zhì)瘤中的谷氨酸能信號(hào)傳導(dǎo)可以是突觸性的,也可以是非突觸性的。為了測(cè)試BDNF對(duì)神經(jīng)元到膠質(zhì)瘤突觸電流的影響,研究者將軸突傳入神經(jīng)(Schaffer側(cè)枝)刺激到植入膠質(zhì)瘤細(xì)胞的海馬CA1區(qū)(圖2f)。暴露于BDNF后,膠質(zhì)瘤EPSCs的振幅增加(圖2g,h)。這些數(shù)據(jù)表明,BDNF增加谷氨酸誘發(fā)電流的強(qiáng)度。為了探索BDNF誘導(dǎo)的電流放大對(duì)細(xì)胞內(nèi)的影響,研究者對(duì)表達(dá)基因編碼鈣指示劑GCaMP6s的異種移植膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行了原位鈣成像(圖2i)。如預(yù)期所示,局部應(yīng)用谷氨酸可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的鈣瞬變(圖2j-l)。在兩種不同的兒童膠質(zhì)瘤患者模型中,BDNF暴露增加了谷氨酸誘發(fā)鈣瞬變的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間(圖2i-l)。

圖2. BDNF-TrkB信號(hào)傳導(dǎo)增加了膠質(zhì)瘤細(xì)胞中谷氨酸能電流的振幅

(圖片源自《Nature》)


在健康神經(jīng)元中,BDNF-TrkB信號(hào)通過CAMKII鈣信號(hào)通路增加AMPARs到突觸后膜的運(yùn)輸(圖3a)。鑒于上述發(fā)現(xiàn)表明,BDNF增加了膠質(zhì)瘤中AMPAR介導(dǎo)的電流和鈣瞬態(tài),研究者下一步研究了BDNF對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中AMPAR轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜的影響。膠質(zhì)瘤細(xì)胞表達(dá)AMPAR亞基GluA2、GluA3和GluA4,暴露于BDNF后,細(xì)胞膜上這些亞基的水平都增加了。為了研究BDNF對(duì)GluA4和GluA3亞基的影響,使用抗體捕獲膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面蛋白,并探索AMPAR亞基的水平。與BDNF增加AMPAR向膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)募僭O(shè)一致,與載體處理的對(duì)照膠質(zhì)瘤細(xì)胞相比,BDNF暴露增加了膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面AMPAR亞基GluA3和GluA4的水平(圖3b-e)。

 

研究者們還生成了一個(gè)氟標(biāo)記的鈣透性異構(gòu)體(GluA2(Q)) 以檢測(cè)GluA2亞基的運(yùn)輸情況。他們?cè)谀z質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)了RFP標(biāo)記的PSD95,以確認(rèn)GluA2在膠質(zhì)瘤突觸后位點(diǎn)的定位。當(dāng)亞基的N端從酸性pH值中移動(dòng)時(shí),熒光蛋白(SEPs)就會(huì)發(fā)出熒光將囊泡運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜外的中性pH值(圖3h)。而后他們將表達(dá)GluA2(Q)-SEP和PSD95-RFP的膠質(zhì)瘤細(xì)胞暴露于酸性培養(yǎng)基(pH5.5)中發(fā)現(xiàn)會(huì)淬滅信號(hào),這表明突觸后點(diǎn)位的AMPAR熒光信號(hào)大部分來自質(zhì)膜結(jié)合的GluA2(圖3i,j)。單個(gè)光斑的時(shí)間過程成像表明,BDNF暴露引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞突觸后GluA2水平的增加(圖3k-m),其時(shí)間尺度與GluA3和GluA4運(yùn)輸?shù)脑黾樱▓D3b-e)和谷氨酸誘發(fā)電流的變化一致。總之,這些發(fā)現(xiàn)表明,BDNF-trkb信號(hào)傳導(dǎo)增加了AMPAR亞基到細(xì)胞膜的運(yùn)輸,導(dǎo)致了上述谷氨酸誘發(fā)電流的增加。


圖3. BDNF調(diào)節(jié)AMPAR到膠質(zhì)瘤突觸后膜的運(yùn)輸

(圖片源自《Nature》)


與前人研究結(jié)果一致的是,研究者使用膜片鉗電生理學(xué)觀察到異種移植的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的一個(gè)子集表現(xiàn)出向內(nèi)電流以響應(yīng)谷氨酸,而NTRK2-KO腫瘤顯示對(duì)谷氨酸有反應(yīng)的細(xì)胞較少(圖4a,b)。研究者先假設(shè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中NTRK2的缺失可能會(huì)改變惡性突觸連通性的程度。為了研究BDNF-TrkB信號(hào)是否調(diào)節(jié)神經(jīng)元到膠質(zhì)瘤突觸連接的數(shù)量,他們對(duì)攜帶表達(dá)GFP的野生型和NTRK2-KO患者來源的膠質(zhì)瘤異種移植小鼠的大腦進(jìn)行了免疫電鏡觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)NTRK2-KO腫瘤中神經(jīng)元到膠質(zhì)瘤的突觸結(jié)構(gòu)比野生型腫瘤少(圖4c,d)。與神經(jīng)元的共培養(yǎng)結(jié)果顯示,同NTRK2野生型膠質(zhì)瘤細(xì)胞相比,NTRK2-KO膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的突觸結(jié)構(gòu)較少,神經(jīng)元的突觸前點(diǎn)與膠質(zhì)瘤突觸后點(diǎn)(PSD95-RFP)共定位(圖4e,f)。在神經(jīng)元-膠質(zhì)瘤共培養(yǎng)物中添加TrkB抑制劑也可以觀察到神經(jīng)元-膠質(zhì)瘤突觸結(jié)構(gòu)的減少(圖4g)。這些數(shù)據(jù)表明BDNF-TrkB信號(hào)調(diào)節(jié)神經(jīng)元到膠質(zhì)瘤的突觸連接。

 

接下來,為了解釋突觸可塑性在膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)中的作用,他們又測(cè)試了去極化電流的大小是否會(huì)差異促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。使用光遺傳學(xué)策略來模擬不同程度的膠質(zhì)瘤突觸強(qiáng)度,通過對(duì)表達(dá)藍(lán)光敏感陽離子通道ChR2的患者源性膠質(zhì)瘤細(xì)胞施加不同的藍(lán)光脈沖持續(xù)時(shí)間(光脈沖寬度)來控制膠質(zhì)瘤膜-膜去極化的幅度。結(jié)果表明,施加5ms或25ms的光脈沖寬度刺激會(huì)導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜的去極化幅度隨著光脈沖的持續(xù)時(shí)間而增加(圖4h,i)。表達(dá)ChR2的異種膠質(zhì)瘤移植物體內(nèi)的去極化顯示,隨著膠質(zhì)瘤膜去極化程度的增加,膠質(zhì)瘤增殖率增加(圖4j,k)。綜上所述,這些數(shù)據(jù)將惡性突觸可塑性與膠質(zhì)瘤病理生理聯(lián)系起來。

總之,這些發(fā)現(xiàn)表明BDNF-TrkB信號(hào)傳導(dǎo)能促進(jìn)惡性突觸可塑性增強(qiáng)從而推動(dòng)腫瘤進(jìn)一步發(fā)展。這一發(fā)現(xiàn)是癌癥神經(jīng)學(xué)的重大突破,為腦膠質(zhì)瘤治療藥物的開發(fā)以及突觸功能障礙相關(guān)疾病的治療奠定了基礎(chǔ)。

 

圖4. 神經(jīng)元-膠質(zhì)瘤連接的可塑性及突觸強(qiáng)度增加對(duì)腫瘤性能的影響

(圖片源自《Nature》)

云克隆開發(fā)了上述研究中相關(guān)指標(biāo)的蛋白、抗體、ELISA試劑盒等產(chǎn)品以助力神經(jīng)腫瘤治療相關(guān)研究,部分指標(biāo)節(jié)選如下,供參考:



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