線粒體外膜透化介導(dǎo)的細(xì)胞死亡——衰老背后的秘密


細(xì)胞衰老是指對(duì)不同應(yīng)激因素的反應(yīng)而發(fā)生的不可逆轉(zhuǎn)的生長停滯。衰老細(xì)胞分泌多種因子,統(tǒng)稱為衰老相關(guān)分泌表型(SASP),線粒體是SASP分泌的主要調(diào)節(jié)器。線粒體是細(xì)胞凋亡所必須的,細(xì)胞凋亡是一種不同于細(xì)胞衰老的細(xì)胞命運(yùn),在細(xì)胞凋亡過程中,廣泛的線粒體外膜透化(MOMP)可介導(dǎo)細(xì)胞死亡。MOMP發(fā)生在線粒體的一個(gè)子集中,是細(xì)胞衰老的一個(gè)特征,這個(gè)過程稱為少數(shù)MOMP(miMOMP),需要BAX和BAK通道將線粒體DNA(mtDNA)釋放到胞漿中,胞漿mtDNA反過來激活cGAS-STING通路,這是SASP的主要調(diào)節(jié)因子,體內(nèi)抑制MOMP可以減少炎癥標(biāo)志物并改善老年小鼠的健康壽命。發(fā)表在《Nature》上的題為“Apoptotic stress causes mtDNA release during senescence and drives the SASP”的最新研究探討了衰老細(xì)胞和受損細(xì)胞導(dǎo)致炎癥的原因,揭開了衰老過程背后的一些生物學(xué)秘密,并提供了一種潛在的新型治療靶標(biāo)。

 

1. miMOMP是細(xì)胞衰老的一個(gè)典型特征

首先通過3D結(jié)構(gòu)光照明顯微成像技術(shù)(SIM)分析MOMP是否存在于衰老細(xì)胞中,檢測線粒體外膜蛋白TOM20和細(xì)胞色素c(Cyt c)在增殖和衰老的人成纖維細(xì)胞中的共定位關(guān)系,研究發(fā)現(xiàn)輻射誘導(dǎo)的衰老細(xì)胞(Sen IR)外周部分線粒體中TOM20和Cyt c的共定位關(guān)系減弱,同時(shí)發(fā)現(xiàn),衰老細(xì)胞胞漿中Cyt c和cleaved caspase-3的含量增加且BAX被大量激活,這些數(shù)據(jù)都表明衰老期間部分線粒體會(huì)發(fā)生MOMP,研究團(tuán)隊(duì)將這一現(xiàn)象稱為miMOMP。

 

                                                                                                                        圖1. miMOMP發(fā)生在細(xì)胞衰老過程中

2. 衰老細(xì)胞中miMOMP導(dǎo)致胞漿mtDNA釋放增加

研究團(tuán)隊(duì)推測衰老細(xì)胞中miMOMP可能釋放mtDNA入胞漿。通過TOM20和DNA的免疫熒光雙染色及透射電鏡觀察免疫膠體金標(biāo)記的DNA水平,結(jié)果均顯示衰老細(xì)胞中的胞漿DNA水平升高。接下來,則要明確這些升高的DNA是否來源于線粒體。通過qPCR檢測mtDNA標(biāo)志物(D-loop)的表達(dá)在衰老細(xì)胞胞漿中升高,并發(fā)現(xiàn)衰老細(xì)胞中大部分胞漿DNA與線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)共定位,TFAM是mtDNA類核的核心成分之一。這些數(shù)據(jù)說明衰老細(xì)胞中miMOMP胞漿mtDNA釋放增加。

 

 

                                                                                                                               圖2. 衰老細(xì)胞中miMOMP釋放mtDNA入胞漿

3. BAX和BAK體內(nèi)外促進(jìn)SASP的分泌

運(yùn)用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建了同時(shí)敲除BAX和BAK的人成纖維細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)BAX和BAK的敲除顯著抑制了衰老細(xì)胞中mtDNA的釋放。進(jìn)一步研究BAX和BAK是否會(huì)影響SASP,進(jìn)行了RNA-seq分析及細(xì)胞因子陣列分析,發(fā)現(xiàn)BAX和BAK的敲除抑制了SASP相關(guān)基因的表達(dá),并降低了促炎細(xì)胞因子水平。研究人員又探究BAX和BAK的敲除是否影響衰老相關(guān)細(xì)胞周期阻滯途徑,發(fā)現(xiàn)BAX和BAK敲除對(duì)細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子p21和p16的基因和蛋白表達(dá)高低無影響,也不影響衰老相關(guān)標(biāo)志物(SA-β-Gal和γH2A.X foci)、衰老相關(guān)的Lamin B1和HMGB1的表達(dá)、增殖標(biāo)志物等的表達(dá)。這些結(jié)果表明,miMOMP通過BAX和BAK促進(jìn)mtDNA釋放到胞漿并調(diào)控SASP,而不調(diào)控衰老相關(guān)細(xì)胞周期阻滯途徑。該結(jié)論進(jìn)一步在體內(nèi)被證實(shí),借助于條件性敲除BAX鼠(Baxfl/flBak-/-)和BAX和BAK雙敲鼠(Bax-/-Bak-/-),Bax-/-Bak-/-鼠顯著抑制了小鼠肝臟促炎細(xì)胞因子表達(dá),且肝臟中CD68+免疫細(xì)胞以及CD45+CD68+免疫細(xì)胞數(shù)量顯著下降,且不影響p16和p21基因表達(dá),表明BAX和BAK可調(diào)控衰老小鼠肝臟SASP分泌,但不影響衰老相關(guān)細(xì)胞細(xì)胞周期變化。

 

 

                                                                                                               圖3. miMOMP通過BAX和BAK促進(jìn)mtDNA釋放到胞漿并調(diào)控SASP

4. mtDNA通過cGAS–STING調(diào)控SASP 

在細(xì)胞凋亡和其他應(yīng)激條件下,胞漿mtDNA激活cGAS-STING信號(hào)通路,且cGAS-STING信號(hào)調(diào)控SASP,然而關(guān)于胞漿mtDNA釋放、cGAS-STING與SASP調(diào)控三者之間的聯(lián)系的研究仍然缺乏。為了探究這一問題,構(gòu)建了無線粒體細(xì)胞,即人成纖維細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)YFP-Parkin,并通過X射線輻照誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。穩(wěn)轉(zhuǎn)YFP-Parkin人成纖維衰老細(xì)胞,用線粒體解偶聯(lián)劑(CCCP)處理,引起衰老細(xì)胞中的線粒體自噬從而耗盡細(xì)胞中的線粒體,然后用分離純化的mtDNA轉(zhuǎn)染無線粒體的衰老細(xì)胞,ELISA結(jié)果顯示胞漿mtDNA水平的增加顯著促進(jìn)了無線粒體衰老細(xì)胞分泌的主要SASP因子IL-6和IL-8的增加。

 

                                                                                                                            圖4. mtDNA促進(jìn)衰老細(xì)胞分泌SASP

接下來探討mtDNA促進(jìn)SASP的機(jī)制,發(fā)現(xiàn)在衰老成纖維細(xì)胞中,GFP-cGAS融合蛋白與胞漿TFAM的共定位水平增加,利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除細(xì)胞中cGAS或STING,發(fā)現(xiàn)cGAS或STING的敲除顯著降低了衰老細(xì)胞SASP中IL-6和IL-8的分泌,而在野生型人成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)染mtDNA后,顯著促進(jìn)了衰老細(xì)胞SASP中IL-6和IL-8的分泌,這些數(shù)據(jù)表明mtDNA通過cGAS-STING調(diào)控SASP分泌。

 

                                                                                                                                  圖5. mtDNA通過cGAS–STING調(diào)控SASP的分泌

5. 抑制MOMP可改善健康壽命

接下來研究通過抑制MOMP是否能抑制mtDNA釋放和SASP分泌。研究團(tuán)隊(duì)使用BAX小分子抑制劑BAI1抑制BAX活性,結(jié)果顯示,經(jīng)BAI1處理的衰老人成纖維細(xì)胞胞漿mtDNA和SASP相關(guān)基因表達(dá)被顯著抑制。那么,抑制MOMP是否可以改善衰老相關(guān)的肌肉力量的下降呢?通過轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BAI1治療可改善與年齡相關(guān)的神經(jīng)肌肉協(xié)調(diào)能力下降,通過前肢握力實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BAI1治療可增強(qiáng)衰老小鼠的前肢握力,顯著改善與衰老相關(guān)的肌肉力量下降。鑒于BAI1處理的老年小鼠中觀察到的肌肉骨骼表現(xiàn)的改善,進(jìn)一步通過微計(jì)算機(jī)斷層掃描(μCT)分析來發(fā)現(xiàn)BAI1處理有效改善脊柱和股骨骨小梁微結(jié)構(gòu),股骨體積分?jǐn)?shù)顯著升高。

 

                                                                                                                                        圖6. 抑制MOMP可改善健康壽命

以上研究結(jié)果說明,細(xì)胞衰老和凋亡受到類似線粒體依賴性機(jī)制的調(diào)節(jié),miMOMP可促進(jìn)mtDNA調(diào)控SASP分泌,抑制miMOMP誘導(dǎo)的炎癥可能是改善健康壽命的一種治療途徑。

云克隆開發(fā)了上述研究中涉及到的相關(guān)靶標(biāo)的蛋白、抗體以及試劑盒產(chǎn)品。靶標(biāo)及核心貨號(hào)如下,供參考:

靶標(biāo)

核心貨號(hào)

靶標(biāo)

核心貨號(hào)

Cyt c

A594

CASP3

A626

Bax

B343

Bcl2

A778

IL6

A079

IL8

A080

IL1a

A071

IL1b

A563

IFNa

A033

IFNb

A222

BAK

C324

Ki-67

C047

APAF1

B054

CD68

B257

CD45

B030

CD38

A752

UQCRC2

G916

p65

A616

Cdkn2a

A794

TFAM

H050

Cxcl15

C069

MFN2

F591

BAI1

C346

p53

A928

Mmp13

A099

Cxcl14

B607

Lamin B1

F548

HMGB1

A399

cGAS

U056

STING

N011

 

 


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