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眾所周知，T細(xì)胞在腫瘤免疫防御體系中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但由于它的激活往往受到抑制性和刺激性免疫檢查點(diǎn)的控制，因此免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá)紊亂會(huì)助力癌細(xì)胞的免疫逃逸。雖然阻斷PD-L1等抑制性免疫檢查點(diǎn)蛋白是目前大多數(shù)癌癥免疫療法的重要靶標(biāo)，但免疫共刺激信號(hào)的缺乏可能會(huì)使這些療法收效甚微甚至毫無(wú)用處。

CD58是一種共刺激配體，在細(xì)胞的抗腫瘤免疫應(yīng)答中起著至關(guān)重要的作用，但控制其表達(dá)的機(jī)制尚不明朗。近日，發(fā)表在《Cancer Cell》上題為“CMTM6 shapes antitumor T cell response through modulating protein expression of CD58 and PD-L1”的研究發(fā)現(xiàn)，CMTM6可以同時(shí)正向調(diào)控免疫共刺激因子CD58和免疫共抑制因子PD-L1，進(jìn)而影響T細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng)。這無(wú)疑為新型免疫療法的開發(fā)打開了新思路。

圖1. 研究思路示意圖（圖片源自《Cancer Cell》）

CMTM6在腫瘤細(xì)胞中共同調(diào)控CD58和PD-L1

前期研究發(fā)現(xiàn)CMTM6是PD-L1的正調(diào)節(jié)因子和分子伴侶，基于此作者定量分析了CMTM6缺失和CMTM6正常表達(dá)腫瘤細(xì)胞的總蛋白質(zhì)組。發(fā)現(xiàn)在CMTM6缺陷細(xì)胞中，除了PD-L1表達(dá)降低外，CD58（LFA-3）也顯著下調(diào)。

鑒于CD58在抗腫瘤免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵作用，作者進(jìn)行了基于FACS的單倍體遺傳篩選，以系統(tǒng)地鑒定該蛋白的調(diào)控者。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CD58^low細(xì)胞群體中CD58位點(diǎn)的破壞性插入高度富集。此外，鑒定出糖基磷脂酰肌醇（GPI）生物合成途徑的組分和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)位復(fù)合物是CD58表達(dá)的調(diào)節(jié)因子，而CMTM6也是其中最重要的調(diào)節(jié)因子之一。

為了驗(yàn)證這一發(fā)現(xiàn)，作者敲除了HAP1細(xì)胞系中的CMTM6。發(fā)現(xiàn)與親代HAP1細(xì)胞相比，CMTM6缺陷細(xì)胞表面CD58表達(dá)降低。此外，在CMTM6缺陷細(xì)胞中重新加入CMTM6表達(dá)可以恢復(fù)CD58的表達(dá)。

上述比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析和單倍體遺傳篩選均顯示CMTM6是CD58免疫檢查點(diǎn)的正調(diào)節(jié)因子。

由于CMTM6先前已被證明維持PD-L1蛋白的表達(dá)，綜合上述結(jié)果研究者提出了一個(gè)大膽假設(shè)：共刺激和共抑制免疫檢查點(diǎn)配體的表達(dá)由相同的調(diào)節(jié)蛋白控制。

為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者在多種癌癥類型的細(xì)胞系中進(jìn)行了CMTM6的缺失和重構(gòu)，包括8505C甲狀腺癌細(xì)胞、A375黑色素瘤細(xì)胞和RKO結(jié)直腸癌細(xì)胞。在A375細(xì)胞中，IFNγ誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)，而CD58表達(dá)不受細(xì)胞因子暴露的影響。CRISPR-Cas9破壞CMTM6會(huì)降低細(xì)胞表面CD58和PD-L1的總蛋白水平。相反，CMTM6的重組恢復(fù)了兩種免疫檢查點(diǎn)配體的表達(dá)。在CD58和PD-L1基礎(chǔ)表達(dá)水平較高的8505C和RKO細(xì)胞中，CMTM6缺失同時(shí)下調(diào)了這兩種免疫檢查點(diǎn)配體，而重新引入CMTM6則恢復(fù)了這種表型。

圖2. CMTM6在腫瘤細(xì)胞中共同調(diào)控CD58和PD-L1（圖片源自《Cancer Cell》）

CMTM6維持CD58蛋白的穩(wěn)定性并與之相互作用

為探究CMTM6介導(dǎo)的CD58調(diào)控機(jī)制，研究者首先比較了CMTM6缺乏和正常表達(dá)細(xì)胞中CD58的mRNA水平。發(fā)現(xiàn)CMTM6缺失不會(huì)降低CD58的RNA轉(zhuǎn)錄物水平，但會(huì)顯著降低細(xì)胞表面和總CD58蛋白水平，表明這種調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。由于CMTM6包含一個(gè)四元跨越的MARVEL（MAL）結(jié)構(gòu)域以及用于囊泡運(yùn)輸和膜連接的相關(guān)蛋白，能促進(jìn)PD-L1的內(nèi)吞循環(huán)并保護(hù)PDL1免于泛素化。基于此作者推測(cè)CMTM6可以通過(guò)類似的機(jī)制調(diào)節(jié)CD58的表達(dá)。為了研究這一點(diǎn)，他們用別藻藍(lán)蛋白（allophycocyanin, APC）偶聯(lián)CD58特異性抗體標(biāo)記細(xì)胞表面表達(dá)的CD58，追蹤和定量APC信號(hào)隨時(shí)間的變化。分析顯示，在CMTM6缺失的情況下，細(xì)胞表面CD58的衰減速度更快。

在真核細(xì)胞中，蛋白質(zhì)降解主要通過(guò)蛋白酶體和溶酶體蛋白水解途徑發(fā)生。隨后，研究者們用蛋白酶體或溶酶體酸化抑制劑孵育細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)兩種抑制劑都延遲了熒光信號(hào)的衰減。值得注意的是，溶酶體抑制顯著降低了CMTM6缺陷細(xì)胞中CD58的降解率，其水平與CMTM6正常細(xì)胞相似。這些結(jié)果表明CMTM6保護(hù)細(xì)胞表面CD58免受溶酶體介導(dǎo)的降解。

由于CMTM6與PDL1和CD58共定位并調(diào)節(jié)其穩(wěn)定性，研究者接下來(lái)評(píng)估了這三種分子之間可能的相互作用。他們用抗CMTM6、抗CD58和抗PD-L1抗體進(jìn)行了免疫共沉淀和免疫印跡分析。在A375細(xì)胞裂解物的抗CMTM6免疫沉淀中，檢測(cè)到CD58和PD-L1。同樣，CMTM6也存在于抗CD58和抗PD-L1免疫沉淀中。然而，在抗CD58免疫沉淀中未檢測(cè)到PD-L1，反之亦然。因此，表明CD58和PD-L1之間不存在直接的相互作用。隨后，作者又通過(guò)細(xì)胞表面免疫沉淀實(shí)驗(yàn)來(lái)確定CMTM6是否與細(xì)胞表面PD-L1和CD58分子相互作用，發(fā)現(xiàn)PD-L1水平在CD58缺失的A375細(xì)胞中略有升高。隨著PDL1水平的升高，PD-L1與CMTM6之間的關(guān)聯(lián)增加。相比之下，腫瘤細(xì)胞中PD-L1的缺失并沒(méi)有導(dǎo)致CD58水平或CMTM6/CD58相互作用的明顯增加。

圖3. CMTM6促進(jìn)細(xì)胞表面CD58的穩(wěn)定性并與之互作（圖片源自《Cancer Cell》）

CMTM6和CD58在T細(xì)胞激活和T細(xì)胞-腫瘤互作中的作用

研究者進(jìn)一步評(píng)估了腫瘤細(xì)胞中CMTM6對(duì)T細(xì)胞激活的影響。他們共培養(yǎng)了由T細(xì)胞1（MART-1）抗原負(fù)載的腫瘤細(xì)胞識(shí)別的黑色素瘤抗原和用MART-1特異性T細(xì)胞受體轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞。在腫瘤識(shí)別后，T細(xì)胞顯示出激活標(biāo)記物（CD137、CD69、IL-2和TNF-a）的表達(dá)增加。此外，PD-L1阻斷進(jìn)一步增強(qiáng)了T細(xì)胞的活化，而CD58阻斷具有相反的效果。

通過(guò)這種共培養(yǎng)模型，他們發(fā)現(xiàn)，與野生型和CMTM6重組的腫瘤細(xì)胞相比，和CMTM6敲除的腫瘤細(xì)胞孵育顯著降低了T細(xì)胞激活標(biāo)志物（CD137和CD69）和T細(xì)胞效應(yīng)因子（IL-2和TNFa）的表達(dá)。同樣，CMTM6缺失導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞活力顯著增加。

考慮到CMTM6在維持細(xì)胞表面CD58和PD-L1表達(dá)中的雙重作用，作者試圖確定這兩個(gè)在T細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞相互作用中具有相反功能的免疫檢查點(diǎn)的相對(duì)重要性。值得注意的是，當(dāng)CD58和PD-L1同時(shí)被阻斷時(shí)，在CD2^high和PD-1⁺T細(xì)胞群中，單獨(dú)阻斷PD-L1所觀察到的T細(xì)胞活化增強(qiáng)被完全消除。實(shí)際上，PD-L1和CD58的共抑制使CD2^high和CD2^inter T細(xì)胞的活化水平低于未處理的對(duì)照組，表明CD58阻斷的主導(dǎo)作用。在A375和8505C細(xì)胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)中，都觀察到CD58阻斷對(duì)T細(xì)胞活化的顯著影響。上述數(shù)據(jù)表明，CD58在抗原特異性T細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞相互作用和對(duì)PD-L1阻斷的反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。

此外，他們還觀察到A375或8505C細(xì)胞中CMTM6的缺失導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞存活率增加。PD-L1抑制增強(qiáng)了T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷，而CD58的抑制則顯著挽救了腫瘤細(xì)胞。與CMTM6缺陷細(xì)胞相比。CD58敲除消除了CMTM6正常表達(dá)細(xì)胞和CMTM6缺乏細(xì)胞對(duì)腫瘤特異性T細(xì)胞和PD-L1阻斷的差異反應(yīng)。相反，當(dāng)CD58在CMTM6缺陷和CMTM6正常表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)時(shí)，這些細(xì)胞的活力在與腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞共培養(yǎng)后下降到一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了CD58在抗原特異性T細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞相互作用和PD-L1阻斷反應(yīng)中的重要作用，CMTM6介導(dǎo)的CD58調(diào)控在此背景下發(fā)揮了重要作用。

圖4. CMTM6、CD58和PD-L1對(duì)抗原特異性T細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞相互作用的影響

（圖片源自《Cancer Cell》）

CMTM6和CD58在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)與ICB治療的臨床反應(yīng)呈正相關(guān)

為了研究人類癌癥中CMTM6和CD58表達(dá)之間的關(guān)系，研究者們使用CMTM6或CD58的抗體對(duì)88個(gè)黑色素瘤樣本和102個(gè)結(jié)腸癌樣本進(jìn)行了免疫組織化學(xué)（IHC）分析。結(jié)果顯示，CMTM6和CD58在兩種癌癥類型樣本的腫瘤細(xì)胞中廣泛分布且大部分重疊表達(dá)（4C）。他們觀察到在88個(gè)黑素瘤中有77個(gè)的CD58染色主要出現(xiàn)在的CMTM6表達(dá)區(qū)域。此外，他們對(duì)CMTM6和CD58在腫瘤細(xì)胞上的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了量化，發(fā)現(xiàn)它們?cè)谀[瘤細(xì)胞中的表達(dá)存在顯著相關(guān)性。

為了評(píng)估CMTM6和CD58表達(dá)與ICB治療反應(yīng)之間的關(guān)系，他們分析了88例晚期黑色素瘤患者的腫瘤活檢。這些患者隨后接受了抗PD-1或抗PD-1/抗CTLA4治療。結(jié)果顯示CMTM6或CD58在這些治療組之間的表達(dá)無(wú)顯著差異。同時(shí)，較高水平的CMTM6或CD58表達(dá)與對(duì)ICB治療的有利反應(yīng)顯著相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了CMTM6介導(dǎo)的CD58調(diào)控在人類腫瘤中的相關(guān)性，并提示其在調(diào)節(jié)對(duì)ICB治療的反應(yīng)中可能起著關(guān)鍵作用。

圖5. 腫瘤細(xì)胞中CMTM6調(diào)控CD58表達(dá)以及它們與ICB治療反應(yīng)之間的關(guān)系

（圖片源自《Cancer Cell》）

免疫檢查點(diǎn)通路在TME中經(jīng)常失調(diào)，從而促進(jìn)癌癥的進(jìn)一步發(fā)展并造成免疫治療的耐藥性。因此，解碼調(diào)節(jié)免疫檢查點(diǎn)分子的分子機(jī)制對(duì)于理解癌癥中的免疫調(diào)節(jié)至關(guān)重要，并且可能預(yù)測(cè)免疫檢查點(diǎn)療法的反應(yīng)并提供新的治療途徑。

云克隆開發(fā)了上述研究中涉及的相關(guān)指標(biāo)的蛋白、抗體、ELISA試劑盒等產(chǎn)品以助力腫瘤治療相關(guān)研究，部分指標(biāo)節(jié)選如下，供參考：

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