Morris水迷宮——為阿爾茨海默癥的研究保駕護(hù)航
今年7月22日，《Science》發(fā)表了一篇?dú)v時(shí)六個(gè)月的調(diào)查報(bào)告，指稱美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)神經(jīng)學(xué)家Sylvain Lesné發(fā)表的20余篇論文存在學(xué)術(shù)不端行為。其中最引人注目的一篇是2006年在《Nature》上發(fā)表的，被引用量高達(dá)2300多次的阿爾茲海默癥的開創(chuàng)性論文，Sylvain Lesné與團(tuán)隊(duì)成員發(fā)現(xiàn)了一種之前未知的β淀粉樣蛋白亞型（Aβ*56）。該文章的通訊作者Ashe教授將Aβ*56稱為在阿爾茨海默研究中，首個(gè)從大腦組織中發(fā)現(xiàn)，且能導(dǎo)致記憶衰退的物質(zhì)。該論文的造假可能導(dǎo)致了對(duì)阿爾茨海默癥淀粉樣蛋白假說(shuō)長(zhǎng)達(dá)16年的誤導(dǎo)性研究，從那時(shí)起，許多工作都集中在淀粉樣蛋白上，進(jìn)展非常緩慢。
圖1.2006年發(fā)表在《Nature》的阿爾茲海默癥開創(chuàng)性論文被引用量
據(jù)統(tǒng)計(jì)，自2006年到2021年，美國(guó)NIH《美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院》對(duì)于“淀粉樣蛋白、寡聚體、阿爾茨海默癥”研究經(jīng)費(fèi)從幾乎為零，猛增到了近3億美元。僅在2022年，NIH在涉及淀粉樣蛋白的項(xiàng)目上花費(fèi)了約16億美元（約合108.14億人民幣），約占阿爾茨海默癥總資金的一半。
阿爾茨海默癥（Alzheimer Disease，AD）是一種起病隱匿的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床上以記憶障礙、失語(yǔ)、失用、失認(rèn)、視空間技能損害、執(zhí)行功能障礙以及人格和行為改變等全面性癡呆表現(xiàn)為特征，病因迄今未明。據(jù)世衛(wèi)組織統(tǒng)計(jì)，目前全球有超過(guò)5500萬(wàn)人患有癡呆癥，給社會(huì)和家庭帶來(lái)巨大的負(fù)擔(dān)，對(duì)阿爾茨海默癥的研究迫在眉睫。
云克隆可為阿爾茨海默癥的疾病模型提供可靠的操作保證：
模型來(lái)源：通過(guò)腦立體定位技術(shù)向雙側(cè)海馬CA1區(qū)注射干擾物質(zhì)（供試品）
建模方案：SD大鼠采用1%戊巴比妥鈉40μg/g腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉后繼而固定于腦立體定位儀上。按照大鼠腦立體定位圖譜，以前囟為零起點(diǎn)，前囟后3.5 mm處為穿刺點(diǎn)，中線右側(cè)旁開2mm，而后牙科鉆鉆開顱骨，采用微量注射器自腦表面垂直進(jìn)針3mm，即：（AP= -3.5 mm, ML=2.0 mm, DV=3.0 mm），雙側(cè)海馬CA1區(qū)緩慢勻速注射，留針5 min，退針后縫合傷口。
圖2.腦立體定位注射操作
Morris水迷宮作為AD模型的經(jīng)典行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，也被稱為AD模型行為學(xué)檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。
云克隆引進(jìn)的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，由圓形水池、圖像自動(dòng)采集和處理系統(tǒng)組成。圖像自動(dòng)采集和處理系統(tǒng)主要由攝像機(jī)、計(jì)算機(jī)、圖像監(jiān)視器組成，動(dòng)物入水后啟動(dòng)監(jiān)測(cè)裝置，記錄動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡，實(shí)驗(yàn)完畢自動(dòng)分析報(bào)告相關(guān)參數(shù)。
圖3. Morris水迷宮圓形水池
1. Morris水迷宮圓形水池
Morris水迷宮圓形水池為一圓柱形水桶，直徑為3000px（小鼠）、高為50-1500px，水池水深為30-1000px，一個(gè)圓形平臺(tái)直徑約為225px（小鼠），藏匿于25px的水面之下。水池的內(nèi)部不得有任何標(biāo)記，在圓桶的上緣等距離地設(shè)東、南、西和北4個(gè)標(biāo)記點(diǎn)，作為動(dòng)物進(jìn)水池的入水點(diǎn)，以這4個(gè)入水點(diǎn)在水面和水桶底部的投影點(diǎn)作為參照位點(diǎn)，將水面和水桶部分均等的分為4個(gè)象限，按實(shí)驗(yàn)要求，可任意地將平臺(tái)設(shè)置于某一象限的中間。適當(dāng)?shù)暮銣卦O(shè)備使水溫保持在23～25℃。
2. 水迷宮圖像自動(dòng)采集和處理系統(tǒng)
本系統(tǒng)能自動(dòng)地采集動(dòng)物的入水位置、游泳的速度、搜索目標(biāo)的所需時(shí)間和運(yùn)行軌跡等參數(shù)，并可對(duì)所采集的各種數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。
圖4. Morris水迷宮視頻界面
實(shí)驗(yàn)步驟
3. Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)步驟
連續(xù)給予受試物后，實(shí)驗(yàn)前一天,小鼠自由游泳2min以熟悉環(huán)境，其間引導(dǎo)動(dòng)物站上平臺(tái)10s。次日開始訓(xùn)練，訓(xùn)練期間繼續(xù)給樣。
定位航行試驗(yàn)：用于測(cè)量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)水迷宮學(xué)習(xí)和記憶獲得的能力。動(dòng)物每次從1個(gè)象限的相同入水點(diǎn)入水，將動(dòng)物面向池壁放入水中，儀器自動(dòng)記錄動(dòng)物尋找并爬上平臺(tái)的路線圖、動(dòng)物從入水到找到水下隱蔽平臺(tái)并站立其上所需時(shí)間(逃避潛伏期)及游泳總路程。每完成4個(gè)象限的訓(xùn)練當(dāng)做1個(gè)循環(huán)，如果動(dòng)物在90s內(nèi)未找到平臺(tái)，則需將其引至平臺(tái)，這時(shí)潛伏期以90s計(jì)，讓動(dòng)物在平臺(tái)停留10s后，再放回籠中。如此重復(fù)完成4個(gè)象限的試驗(yàn)，總共訓(xùn)練5天，也就是四個(gè)循環(huán)，象限選擇和各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物訓(xùn)練順序應(yīng)隨機(jī)確定或交叉進(jìn)行。
空間探索試驗(yàn)：定位航行試驗(yàn)結(jié)束5天后，將水下平臺(tái)撤除，按照定位航行試驗(yàn)的方法重復(fù)1個(gè)循環(huán)（共4個(gè)象限）的試驗(yàn)，動(dòng)物每次從1個(gè)象限的入水點(diǎn)入水，記錄90s內(nèi)小鼠在水池4個(gè)象限中的游泳距離、路徑、時(shí)間，據(jù)此推算平臺(tái)所在象限數(shù)據(jù)占總距離、總時(shí)間的百分比及穿越平臺(tái)的次數(shù)，用來(lái)反映大鼠對(duì)平臺(tái)所在位置的空間記憶能力，以判斷動(dòng)物記憶儲(chǔ)存及提取再現(xiàn)能力。
4. 數(shù)據(jù)處理
將每天動(dòng)物1個(gè)循環(huán)（共4個(gè)象限）的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)合并統(tǒng)計(jì)，對(duì)每1個(gè)循環(huán)各組的結(jié)果進(jìn)行比較分析。
逃避潛伏期、上臺(tái)前游泳路程、平臺(tái)象限活動(dòng)時(shí)間占總時(shí)間百分比、平臺(tái)象限活動(dòng)路程占總距離百分比、站臺(tái)穿越次數(shù)屬計(jì)量資料，可用unpaired T test進(jìn)行差異性分析。結(jié)論：NS，組間差異無(wú)顯著性；*（P<0.05），組間5%的顯著性差異；**（P<0.01），組間1%的顯著性水平顯著；***（P<0.001），組間1‰的顯著性差異。
針對(duì)學(xué)習(xí)與記憶行為學(xué)檢測(cè)方面，云克隆還可為廣大用戶提供：
