ITLN1通過代謝轉移抑制卵巢癌細胞的發(fā)展
2020年7月15日，來自密歇根大學生物醫(yī)學工程系的Deepak Nagrath 教授和德克薩斯大學MD安德森癌癥中心的Samuel C. Mok 教授在《Nature communications》聯(lián)合發(fā)表了題為“ITLN1 modulates invasive potential and metabolic reprogramming of ovarian cancer cells in omental microenvironment”的文章。研究探討了調節(jié)卵巢癌擴散到大網膜組織的分子機制，發(fā)現(xiàn)ITLN1通過降低MMP1的表達和誘導轉移性卵巢癌細胞的代謝轉移，抑制了乳轉鐵蛋白對卵巢癌細胞侵襲潛能和增殖的影響。此外，接受ITLN1治療的卵巢癌小鼠腫瘤生長速度明顯下降。這些數(shù)據表明，在大網膜腫瘤微環(huán)境中，來自間皮細胞的ITLN1的下調促進了卵巢癌的發(fā)展。
產品：內凝集蛋白1 ELISA Kit
貨號：SEA933Mu
實驗方法：雙抗夾心
檢測范圍：2.5-160pg/mL
研究簡介：
上皮性卵巢癌(Ovarian cancer, OC)是美國死亡人數(shù)最多的婦科惡性腫瘤。它最常見于絕經后婦女，并優(yōu)先轉移到大網膜。大網膜是一種血管化良好的腹膜組織皺褶，是腹腔內脂肪聚集的主要部位。這些觀察結果表明，內臟脂肪作為轉移微環(huán)境的組成部分，可能對OC的發(fā)展產生負面影響。然而，大網膜內臟組織促進腫瘤生長和疾病進展的機制尚不完全清楚。以往的研究表明，脂肪組織可能對腫瘤的生長、轉移和化療敏感性有直接的、局部的影響。
許多研究表明，腫瘤細胞與間皮細胞的透明質酸膜結合，以及炎癥介質和潛在的細胞外基質暴露引起癌細胞粘附分子的上調，可能促進癌細胞的附著和侵襲。然而，OC的間皮細胞的在細胞粘附和增長的確切作用尚不清楚。并且，OC細胞在網膜脂肪組織中調控間皮細胞以及其他類型的細胞以創(chuàng)建一個環(huán)境支持他們的成長和發(fā)展的分子機制也沒有進行過徹底的探索。
首先，作者對良性婦科疾病患者顯微解剖的大網膜脂肪組織和高度嚴重卵巢癌(High-grade serous ovarian cancer，HGSC)患者的癌相關大網膜組織進行了轉錄組分析，發(fā)現(xiàn)HGSC患者的大網膜脂肪組織中ITLN1下調最多，說明OC細胞下調了大網膜脂肪組織中ITLN1的表達。同時，對健康女性的大網膜脂肪組織和HGSC患者的腹水衍生的間皮細胞進行RNA-Seq，發(fā)現(xiàn)ITLN1是癌癥相關間皮細胞中表達下調最多的基因。
基于間皮細胞是大網膜組織的主要成分之一，作者推測大網膜脂肪組織中的ITLN1主要是由間皮細胞產生的。通過比較健康女性和HGSC患者原代間皮細胞中ITLN1的mRNA和蛋白水平并對ITLN1進行免疫定位，發(fā)現(xiàn)在大網膜的各種細胞中，內源性ITLN1只有間皮細胞高表達，而間皮細胞中ITLN1的下調與大網膜微環(huán)境中OC細胞或細胞分泌的介質的存在有關。
因為ITLN1是一種分泌蛋白，因此作者檢測了測定了健康女性血清樣本中的循環(huán)ITLN1水平，以及術前HGSC患者和良性婦科疾病患者的血清樣本。結果發(fā)現(xiàn)，與健康女性或良性婦科疾病患者相比，HGSC患者循環(huán)中的ITLN1水平顯著降低。由于OC患者血清中CA125蛋白水平升高，作者對患者血清中CA125和ITLN1蛋白水平之間是否存在相關性進行實驗。發(fā)現(xiàn)HGSC患者的CA125水平明顯高于正常女性或良性婦科疾病患者，并且CA125和ITLN1水平之間存在顯著的負相關。之后使用logistic回歸法構建了ITLN1、CA125或兩者的受試者工作特征曲線以檢驗健康女性和OC女性之間的區(qū)分能力。數(shù)據表明，ITLN1補充了CA125在OC患者識別中的作用。
為了評估ITLN1在OC進展中的作用，作者進行了細胞侵襲實驗和遷移實驗。發(fā)現(xiàn)與磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)處理的SKOV3和A224相比，ITLN1處理的細胞的行走距離明顯縮短，侵襲程度明顯降低。說明外源性ITLN1可以抑制OC的轉移。為了確定ITLN1抑制OC細胞運動和侵襲電位的分子機制，作者對外源性ITLN1處理的A224進行了轉錄組分析。從轉錄組中，作者選擇了與侵襲和轉移相關的基因MMP1進行研究。因為mRNA 和蛋白在ITLN1處理的SKOV3和A224細胞中均下調，表明MMP1介導了ITLN1對OC細胞運動和侵襲電位的影響。
為了確定ITLN1下調MMP1的信號網絡，作者首先將目標放在LTF（Lactotransferrin）上。前人研究發(fā)現(xiàn)LTF能與膜結合形式的ITLN1互作，并且LTF與LRP1（Low-intensity lipoprotein-receptor-related protein 1）結合轉錄上調MMP1。因此推測ITLN1與LTF結合，阻止LTF與OC細胞上的受體LRP1結合，進而導致MMP1下調。首先，作者進行了體外pull-down實驗表明ITLN1和LTF結合。通過Duolink PLA技術進一步證明ITLN1干擾了OC細胞上LTF與LRP1的結合。作者發(fā)現(xiàn)大部分LTF信號在大網膜組織中共定位，提示中性粒細胞是大網膜腫瘤微環(huán)境中LTF的主要來源。并且通過免疫組化分析，HGSC患者的癌相關脂肪組織中LTF表達顯著上調。HGSC患者腹水中富含中性粒細胞的LTF水平明顯高于任何一組患者的血清。Logistic回歸法構建工作特征曲線，發(fā)現(xiàn)LTF聯(lián)合ITLN1和CA125時的曲線下面積明顯大于單獨聯(lián)合CA125時的曲線下面積，說明LTF聯(lián)合ITLN1在OC患者識別中可補充CA125。
作者將ITLN1在含有10%胎牛血清(FBS)的抗LTF抗體或IgG的培養(yǎng)液中處理OC細胞，與SFM種相比，細胞運動和侵襲電位明顯提高；當ITLN1加入后，運動和侵襲明顯下降。這表明ITLN1抑制了LTF對OC細胞運動和侵襲的影響。當SKOV3和A224轉染MMP1-specific siRNAs然后用LTF處理后，發(fā)現(xiàn)LTF對OC細胞的運動和侵襲影響消失，這表明LTF對OC細胞的影響可能通過MMP1介導。
在檢測了LTF/LRP1/MMP1通路中關鍵中間信號分子在SKOV3和A224中的表達水平后發(fā)現(xiàn)，ITLN1可以消除LTF對這些信號分子的激活作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)LTF處理的SKOV3和A224的應力纖維形成和細胞內鈣顯著增加。然而，ITLN1的加入卻減弱了LTF的作用，這表明ITLN1通過調節(jié)OC細胞中鈣和應力纖維的形成，減弱了LTF的促進基序的作用。
之后，作者發(fā)現(xiàn)ITLN1對OC細胞的生長沒有直接影響，但是OC細胞和成熟脂肪細胞和ITLN1共培養(yǎng)的細胞生長速率顯著下降，將成熟脂肪細胞替換為前脂肪細胞和間皮細胞未觀察到生長抑制作用，這說明只有成熟脂肪細胞介導了ITLN1對OC細胞的生長抑制作用。
然后，作者證實ITLN1僅在成熟的脂肪細胞中增加了胰島素依賴性的葡萄糖攝取，而葡萄糖能介導OC細胞的生長。實驗發(fā)現(xiàn)，在胰島素存在的情況下，ITLN1上調了脂肪細胞中GLUT4的表達，導致葡萄糖攝取增加。然而，在ITLN1處理的成熟脂肪細胞中，與對照組相比，在沒有胰島素的情況下，GLUT4 mRNA的表達沒有顯著變化。沉默GLUT4后ITLN1處理的成熟脂肪細胞葡萄糖攝取量顯著降低。這表明ITLN1通過上調GLUT4來增加脂肪細胞的葡萄糖攝取，從而抑制OC的生長。
卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中死亡率最高的疾病。卵巢癌早期癥狀不明顯，約65%的患者確診時已處于晚期，死亡率較高。早期診斷者5年生存率可達92%，但是臨床上僅有15%的患者在此階段被確診。由此可見卵巢癌的生存率有賴于早期的診斷和治療，卵巢癌生物標志物具有采樣簡單、操作方便等多方面的特點，被認為是理想的早期診斷指標和預后跟蹤指標。
云克隆提供卵巢癌生物學標志物相關的多種指標蛋白、抗體以及ELISA試劑盒產品，廣泛的應用于人、小鼠、大鼠、豬、羊等多個物種的檢測。
裸鼠成瘤模型
皮下成瘤
動物品系：SPF 級無胸腺 Balb/C-nude 裸鼠，雄性，周齡為 4-5W，體重為 15-20g
建模方法：將標準條件下培養(yǎng)的處于對數(shù)生長期的 HepG2 細胞消化、離心，將所得的約 5×10^6個細胞溶于 0.1 mL DMEM 培養(yǎng)液，注射于裸鼠右側背部皮下。
肝臟原位成瘤
動物品系：SPF 級胸腺 Balb/C 裸鼠，周齡為 4-6W，體重為 15-20g
建模方法：將標準條件下培養(yǎng)的處于對數(shù)生長期的 HepG2-luc 細胞消化、離心，將所得的約 5×10^6個細胞溶于 0.1 mL DMEM 培養(yǎng)液待用。麻醉小鼠，待麻醉生效后，開腹暴露肝臟，用 1ml胰島素注射針取準備好的細胞注射于裸鼠肝臟內，用 5-0 絲線縫合傷口，活力碘消毒傷口，將裸鼠放在加熱墊上，待清醒后正常飲食飼養(yǎng)。活體成像檢測：在成瘤后對裸鼠進行熒光活體成像檢測，成像前麻醉小鼠，再通過腹腔注射 3mg 底物 luciferin，底物注射 10 分鐘后進行熒光活體成像檢測。圖 1 為裸鼠 HepG2-luc 細胞肝臟原位注射 1 周后熒光活體成像圖。
