PNGase F活性測(cè)定
實(shí)驗(yàn)原理
肽-N-糖苷酶F（PNGase F），可以在N-連接糖蛋白的高甘露糖、雜合和復(fù)合寡糖部分最內(nèi)側(cè)的N-乙酰葡萄糖胺和天冬酰胺殘基之間進(jìn)行切割。本試驗(yàn)以真核表達(dá)的重組Interferon Gamma（IFNg）蛋白為底物來(lái)測(cè)定重組肽-N-糖苷酶F的活性。
實(shí)驗(yàn)試劑及儀器
試劑：10×變性緩沖液：5% SDS，400mM DTT
反應(yīng)緩沖液：50mmol/L Tris (pH7.4)，150mM NaCl，1% NP-40
儀器：SDS-PAGE電泳儀
實(shí)驗(yàn)步驟
將真核蛋白Interferon Gamma （IFNg）用1×變性緩沖液稀釋成1μg/μL，在100℃煮沸10min使其變性。將重組蛋白PNGase F用反應(yīng)緩沖液從1000ng/mL開始進(jìn)行兩倍稀釋，每個(gè)濃度取10μL，再加入10μL變性IFNg蛋白在37℃下反應(yīng)1h，最后在100℃煮沸5min終止反應(yīng)，用SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果。
結(jié)果及計(jì)算
酶活定義：
在10μL反應(yīng)體系中，37℃條件下，1小時(shí)從10μg變性IFNg中去除超過(guò)95%的碳水化合物所需的酶量定義為一個(gè)單位。
Figure 1. The deglycosylation of IFNg detect by SDS-PAGE
結(jié)果顯示，37℃條件下，1小時(shí)從10μg變性IFNg中去除超過(guò)95%的碳水化合物所需的PNGase F為2.5ng。
參考信息
云克隆貨號(hào)：APX267Ge01