抗CD45抗體用于吞噬作用研究——云克隆抗體又登Cell
文章主題：Size-Dependent Segregation Controls Macrophage Phagocytosis of Antibody-Opsonized Targets
簡(jiǎn)單來(lái)說：抗原的大小是巨噬細(xì)胞進(jìn)行有效吞噬的決定性因素
信息及鏈接：Cell. 2018 Jun 28;174(1):131-142.e13. doi: 10.1016/j.cell.2018.05.059.
背景：巨噬細(xì)胞通過靶向抗體調(diào)理細(xì)胞進(jìn)行吞噬作用來(lái)保護(hù)機(jī)體免受疾病損傷。盡管不同結(jié)構(gòu)，形狀和大小的抗原都能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，但是為什么有些抗體在激發(fā)免疫應(yīng)答等過程中比其他抗體更有效，這個(gè)機(jī)制還不清楚。在這篇文章中，研究者們就對(duì)其中的機(jī)制進(jìn)行了研究。
亮點(diǎn)：
1. 抗體依賴的巨噬細(xì)胞吞噬作用依賴于抗原的大??；
2. 短抗原促進(jìn)細(xì)胞之間的緊密接觸以及CD45的分離；
3. CD45的分離不依賴于整合素，會(huì)引起ITAM的磷酸化；
4. 靶向短抗原的抗體促進(jìn)有效的吞噬作用。
下面我們來(lái)看看研究者們是怎么通過精巧的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，最終得到這些結(jié)論的：
首先，通過設(shè)計(jì)一組體外模型（包裹脂質(zhì)雙分子層（SLB）和抗體的玻璃微球）模擬被巨噬細(xì)胞吞噬的靶物質(zhì)，然后將微球與RAW264.7巨噬細(xì)胞細(xì)胞共孵育，通過共聚焦顯微技術(shù)觀察體外模擬的巨噬細(xì)胞吞噬過程。
結(jié)果顯示：吞噬作用隨著抗體濃度的升高而增強(qiáng)，同時(shí)，還能通過與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的抗CD16（Fc?RIII）和抗CD32（Fc?RIIIB）的抗體共孵育而被阻斷，說明SLB包裹的微球內(nèi)化是Fc?R特異性的。
此后，為了了解抗原大小對(duì)于吞噬作用的影響，研究者們先后設(shè)計(jì)了兩組基于Fibcon和CEACAM的不同長(zhǎng)度的抗原。觀察吞噬過程發(fā)現(xiàn)：巨噬細(xì)胞對(duì)微球的吞噬作用隨著微球上包裹抗原增長(zhǎng)而顯著降低。
由于吞噬作用和抗體濃度是相關(guān)的，所以為了證明抗原長(zhǎng)度對(duì)吞噬作用的影響不僅僅發(fā)生在某個(gè)特定的抗體濃度，研究者又設(shè)計(jì)了不同抗體濃度下的實(shí)驗(yàn)。（邏輯是不是很縝密？）
結(jié)果顯示：不同的抗體濃度下吞噬作用與抗原長(zhǎng)度還是呈負(fù)相關(guān)的趨勢(shì)，并且當(dāng)抗原長(zhǎng)度大于10nm時(shí)，會(huì)顯著降低吞噬作用。
接下來(lái)，為了研究吞噬依賴于抗原長(zhǎng)度的原因是否在于ITAM信號(hào)變化，研究者們觀察了吞噬過程中磷酸化酪氨酸在細(xì)胞中的分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：短抗原內(nèi)化過程中有豐富的ITAM酪氨酸磷酸化，但長(zhǎng)抗原則沒有。
而為了確定Fc?R ITAM磷酸化是否隨著抗原長(zhǎng)度改變而發(fā)生了變化，他們應(yīng)用全內(nèi)反射熒光顯微鏡（TIRF）對(duì)特定設(shè)計(jì)的ITAM磷酸化傳感器（sensor）進(jìn)行觀察，了解ITAM磷酸化的動(dòng)力學(xué)。
結(jié)果顯示：隨著抗原長(zhǎng)度增加，sensor的富集程度顯著降低，并且，這種依賴于抗原大小的Fc?R ITAM磷酸化還不僅僅出現(xiàn)在單個(gè)的抗原家族中，也就是說有一定的普遍性。
進(jìn)一步來(lái)說，由于靶物質(zhì)上抗體濃度可以調(diào)節(jié)吞噬作用，為了確定不同長(zhǎng)度的抗原簇中Fc?R的有效濃度不同是不是導(dǎo)致吞噬作用與抗原長(zhǎng)度相關(guān)性的主要原因，通過計(jì)量抗體-Fc?R復(fù)合物的濃度發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)抗原對(duì)應(yīng)的抗體濃度比短抗原只有輕微降低，而這個(gè)現(xiàn)象可以由二維空間內(nèi)受體-配基的親和力依賴于他們的大小尺寸得以解釋。進(jìn)而研究者們還通過構(gòu)建大質(zhì)膜泡，檢測(cè)到抗原長(zhǎng)度變化只會(huì)引起受體-配基親和力的輕微降低，進(jìn)而說明吞噬作用主要依賴于抗原大小的差異，而不是親和力或者密度。
Fc?R ITAM的磷酸化能夠被受體酪氨酸磷酸酶CD45、CD148逆轉(zhuǎn)，為了研究抑制磷酸酶在抗體Fc?R富集的膜上是怎樣進(jìn)行空間分布的，研究者們通過TIRF觀察了CD45在巨噬細(xì)胞和SLB的接觸面上的分布。
結(jié)果顯示：短抗原參與的吞噬接觸面上抗體與CD45之間有顯著的分離，而長(zhǎng)抗原則沒有這種現(xiàn)象。同時(shí)，共定位分析及抗原、抗體及受體的計(jì)算分析顯示：大約10nm的大小是一個(gè)閾值，當(dāng)抗原長(zhǎng)度小于這個(gè)閾值就會(huì)導(dǎo)致CD45被分離。
基于以上的結(jié)論，為了進(jìn)一步求證CD45的分離對(duì)于Fc?R磷酸化和吞噬作用是否是必須的，研究者們使用CRISPR/Cas9截短了內(nèi)源性的CD45胞外段進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)截短的CD45使短抗原介導(dǎo)的吞噬作用顯著降低了。
綜上，結(jié)論如下：抗原大小很大程度上決定了抗體依賴的吞噬作用是否成功，而這個(gè)吞噬作用又是通過大小依賴的CD45分離導(dǎo)致的Fc?R磷酸化來(lái)完成的。（做基礎(chǔ)研究的文章，它的結(jié)論就是這么傲嬌的拗口）
簡(jiǎn)單來(lái)說，是這樣一個(gè)結(jié)論：
抗原大小越小會(huì)導(dǎo)致抗體結(jié)合的Fc受體與抑制性磷酸酶CD45分離，進(jìn)而激發(fā)Fc受體磷酸化，并促進(jìn)吞噬作用。由此作者為治療性抗體提出一個(gè)建議：選取短抗原作為抗體的靶標(biāo)。
本文中用于檢測(cè)CRISPR/Cas9編輯的CD45分子的抗小鼠CD45抗體來(lái)自Cloud-Clone?。。?/p>