半胱天冬酶Caspase-1酶聯(lián)免疫檢測試劑盒應(yīng)用于ATP 與LPS共激活的單核細(xì)胞中Caspase-1的定量測定
Caspase家族作為細(xì)胞凋亡過程中的中心環(huán)節(jié)和執(zhí)行者，與細(xì)胞凋亡等形態(tài)學(xué)特征密切相關(guān)，近年來受到了廣泛的關(guān)注。Caspase-1是Caspase 家族第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的蛋白，早在1992年人類就克隆并測序其cDNA，隨后Caspase家族相繼共有14個(gè)成員被克隆出。Caspase-1作為凋亡機(jī)制中重要的效應(yīng)成分，主要參與細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)并在死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中起輔助作用，參與IL- 1β 的成熟和轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)還參與凋亡有關(guān)的生理和病理過程，在諸如生長因子、熱休克、細(xì)胞因子和DNA損傷劑等刺激作用下，共同介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多種凋亡信號傳導(dǎo)途徑。
近年來有關(guān)Caspase-1的表達(dá)研究十分的活躍，其中的研究熱點(diǎn)就是ATP及脂多糖LPS共激活Caspase-1的表達(dá)。圖1是ATP及LPS共激活的信號通路（參考Animal Biotechnology），從中可以看到，當(dāng)給予ATP 及LPS刺激作用于單核細(xì)胞后，可以提高位于細(xì)胞膜上的受體蛋白P2X7的表達(dá)量，從而導(dǎo)致ca離子內(nèi)流，k離子外流，這種離子流進(jìn)一步激活NLRP3蛋白的表達(dá)，從而激活pro-caspase-1的蛋白表達(dá)量，進(jìn)而提高Caspase-1的表達(dá)量。
Cloud-Clone Corp.公司研制的Caspase-1酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(SEB592Hu)可準(zhǔn)確定量檢測THP-1細(xì)胞中Caspase-1的含量。
圖1：ATP及LPS共激活Caspase-1的信號通路
實(shí)驗(yàn)方案：
一，ATP誘導(dǎo)激活Caspase-1的表達(dá)
1）收集人的單核細(xì)胞THP-1，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基RPMI1640，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)細(xì)胞使其濃度達(dá)到106/ml，再加入1ml RPMI1640培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)。
2）過夜培養(yǎng)12h的細(xì)胞，加入終濃度為1ug/ml的LPS，刺激培養(yǎng)3h后，再次加入終濃度為5mM的ATP溶液（100mM，pH =7）激活培養(yǎng)2h。
二，THP-1細(xì)胞上清及內(nèi)含物的收集
培養(yǎng)好的細(xì)胞，收集細(xì)胞上清及細(xì)胞。對于上清液，1000g離心20分鐘，將上清用于后續(xù)的含量檢測。細(xì)胞內(nèi)含物，先用預(yù)冷的PBS洗3次，用物理（超聲破粹或者反復(fù)凍融）或者化學(xué)方法（細(xì)胞裂解液）裂解細(xì)胞，1000g離心20分鐘，取上清進(jìn)行檢測。
三，Caspase-1的定量檢測
分別取上清溶液，使用半胱天冬酶Caspase-1酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(SEB592Hu)定量檢測樣本中Caspase-1的含量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
ATP及LPS處理THP-1細(xì)胞后，細(xì)胞上清和細(xì)胞裂解液中的Caspase-1的表達(dá)量如圖2所示：
THP-1細(xì)胞在加入ATP及LPS處理后，細(xì)胞上清和細(xì)胞裂解液中的Caspase-1的表達(dá)量均增加，尤其是細(xì)胞裂解液中的Caspase-1的表達(dá)量明顯高于未處理組， Caspase-1的表達(dá)量大約增加了24倍，這也很好的佐證了Caspase-1定位表達(dá)于THP-1細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)研究。