重組蛋白的詳細(xì)構(gòu)建方法
應(yīng)用重組DNA將目標(biāo)基因進(jìn)行表達(dá)得到的蛋白質(zhì)成為重組蛋白，重組蛋白在生物信號(hào)傳導(dǎo)過程，藥物研發(fā)，科學(xué)研究中扮演著重要角色。下面來介紹一下重組蛋白的生產(chǎn)工藝流程。
1.基因擴(kuò)增
（1）引物合成
搜索目標(biāo)蛋白基因信息，結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)信息，選取片段或全長(zhǎng)設(shè)計(jì)引物。注意避開跨膜區(qū)，以及復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，優(yōu)選N端或C端，引物評(píng)分盡可能高，并搜索出核酸序列的酶切位點(diǎn)，使用載體等信息。經(jīng)研發(fā)部根據(jù)研發(fā)經(jīng)驗(yàn)提出修改意見最終定稿后交由第三方公司進(jìn)行引物合成。
（2）基因克隆機(jī)重組鑒定
1）PCR
根據(jù)目的蛋白特異性表達(dá)組織，選取特異組織RNA用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，根據(jù)分子量大小選取目標(biāo)片段進(jìn)行切膠回收。再次PCR擴(kuò)增，獲得大量DNA，并進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收。
2）酶切，連接
根據(jù)酶切位點(diǎn)，將目標(biāo)PCR產(chǎn)物以及相應(yīng)載體進(jìn)行酶切，獲得粘性末端的DNA產(chǎn)物后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)目標(biāo)條帶大小選取相應(yīng)片段切膠回收。并將具有相同酶切位點(diǎn)的載體與DNA片段進(jìn)行連接
3）轉(zhuǎn)化，挑菌驗(yàn)證
將連接好的目的片段轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli,并在LB平板上進(jìn)行過夜培養(yǎng)。挑取平板上的菌斑進(jìn)行驗(yàn)證PCR，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)目標(biāo)條帶大小選取相應(yīng)菌液進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確后留種保存。
2.蛋白表達(dá)
（1）蛋白表達(dá)小試
挑取少量菌種進(jìn)行培養(yǎng)，并誘導(dǎo)表達(dá)，將表達(dá)的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，根據(jù)目標(biāo)條帶大小判斷目標(biāo)蛋白是否表達(dá)，小試表達(dá)成功后將進(jìn)行蛋白預(yù)放大實(shí)驗(yàn)
（2）蛋白放大實(shí)驗(yàn)
將小試表達(dá)成功的蛋白菌株用400-800 ml培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)表達(dá)，進(jìn)行SDS-PAGE，根據(jù)目標(biāo)條帶大小判斷目標(biāo)蛋白是否表達(dá)成功，預(yù)放大實(shí)驗(yàn)成功后將進(jìn)行進(jìn)一步的蛋白放大實(shí)驗(yàn)，放大實(shí)驗(yàn)使用800-1600 ml培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，具體驗(yàn)證同上。
3.蛋白純化
由于載體中包含了his標(biāo)簽，故采用鎳柱進(jìn)行純化。有些蛋白可能會(huì)形成包涵體，在之前的一篇專題中我們有詳細(xì)介紹過大腸桿菌重組蛋白純化方法,純化后的蛋白會(huì)進(jìn)行SDS-PAGE， BCA等實(shí)驗(yàn)分子量以及純度進(jìn)行驗(yàn)證，純度超過95%。
4. 質(zhì)量檢測(cè)
獲得蛋白后會(huì)進(jìn)行凍干，凍干之后會(huì)進(jìn)行常規(guī)蛋白實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，合格后保存。
重組蛋白的制備主要是依據(jù)以上原理及步驟。以上是以原核表達(dá)舉例。在制備過程中每一個(gè)環(huán)節(jié)都至關(guān)重要，不同的蛋白會(huì)在不同的環(huán)節(jié)出現(xiàn)技術(shù)難點(diǎn)，包括目的基因的擴(kuò)增，包涵體的形成都會(huì)對(duì)重組蛋白的研發(fā)造成困境。但Cloud Clone Corp. 具有多年研發(fā)經(jīng)驗(yàn)，還可提供真核表達(dá)系統(tǒng)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，用戶可根據(jù)需要選擇，同時(shí)對(duì)蛋白有特殊要求我們也可提供私人定制。
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