天然免疫的古老家族成員Toll樣受體2
Toll like receptor, Toll 樣受體，可識(shí)別外源性微生物，并引發(fā)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)， 促進(jìn)炎性介質(zhì)的釋放，啟動(dòng)天然免疫反應(yīng)。目前已發(fā)現(xiàn)的 TLRs 家族成員共有 10 多個(gè)，其中 TLR2 是目前已克隆人類(lèi) TLRs 家族中表達(dá)范圍最廣，識(shí)別病原微生物 及產(chǎn)物種類(lèi)最多的分子，廣泛的分布于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹(shù)突細(xì) 胞及上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中。鑒于 TLR2 在天然免疫中的重要作用，深入研究該蛋 白具有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。Cloud-Clone Corp. 公司針對(duì)該蛋白研制出了 重組蛋白、抗體和 ELISA 檢測(cè)試劑盒等一系列檢測(cè)工具，供廣大研究者使用。
通過(guò)蛋白結(jié)構(gòu)分析得知，TLR2 為 I 型跨膜蛋白，其序列分為胞外段、跨膜段 和胞內(nèi)段。由于 TLR2 胞外區(qū)含有 19 個(gè) LRR 重復(fù)區(qū)域，通過(guò)抗原表位分析、蛋白 結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，以及蛋白可溶性分析后，選定 Pro47-Gly245 片段作為表達(dá)的 TLR2 重 組蛋白。該片段為胞外片段，方便有需要的研究者對(duì)該蛋白進(jìn)行研究。根據(jù) NCBI 中 NM_003264.3 的 CDS（編碼 TLR 的核酸序列）設(shè)計(jì)引物，由于序列中有 EcoRI 酶切位點(diǎn)，在上下游引物中分別含有一個(gè) BamHI 和一個(gè) Xhol 的酶切位點(diǎn)，用于后 期重組載體的構(gòu)建：
[PRIMER INFORMATION]
Upstream Primer:CGCggatccGAATCCTCCAATCAGGCTTCTCTG
Downsream Primer: CCGctcgagTCACAGTGCTGTCCTGTGACATTCCGAC
完成引物設(shè)計(jì)后，利用 PCR 技術(shù)獲得片段為 600bp 的 DNA 片段。測(cè)序正確后， 采用傳統(tǒng)的雙酶切將擴(kuò)增片段與 Cloud-Clone Corp.自主構(gòu)建的大腸桿菌表達(dá)載體 pUSCNK-1 進(jìn)行連接，完成表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，測(cè)序結(jié)果如圖 1 所示。
1 CCCTCAGGGCTCACAGAAGCTGTAAAAAGCCTTGACCTGTCCAACAACAGGATCACCTAC
61 ATTAGCAACAGTGACCTACAGAGGTGTGTGAACCTCCAGGCTCTGGTGCTGACATCCAAT
121 GGAATTAACACAATAGAGGAAGATTCTTTTTCTTCCCTGGGCAGTCTTGAACATTTAGAC
181 TTATCCTATAATTACTTATCTAATTTATCGTCTTCCTGGTTCAAGCCCCTTTCTTCTTTA
241 ACATTCTTAAACTTACTGGGAAATCCTTACAAAACCCTAGGGGAAACATCTCTTTTTTCT
301 CATCTCACAAAATTGCAAATCCTGAGAGTGGGAAATATGGACACCTTCACTAAGATTCAA
361 AGAAAAGATTTTGCTGGACTTACCTTCCTTGAGGAACTTGAGATTGATGCTTCAGATCTA
421 CAGAGCTATGAGCCAAAAAGTTTGAAGTCAATTCAGAATGTAAGTCATCTGATCCTTCAT
481 ATGAAGCAGCATATTTTACTGCTGGAGATTTTTGTAGATGTTACAAGTTCCGTGGAATGT
541 TTGGAACTGCGAGATACTGATTTGGACACTTTCCATTTTTCAGAACTATCCACTGGTTGA
圖1 pUSCNK-1 hTLR2測(cè)序結(jié)果
將該序列與NCBI中TLR2的基因序列進(jìn)行對(duì)比，相似性為100%。進(jìn)一步證明 擴(kuò)增序列的正確性。序列對(duì)比結(jié)果如圖2
圖2 核酸序列對(duì)比結(jié)果
之后，通過(guò) IPTG 誘導(dǎo)重組蛋白體外表達(dá)，獲得一個(gè)大小約 29KD 的重組蛋白， 基于表達(dá)獲得的重組蛋白有 His 標(biāo)簽，后期純化采用鎳柱純化，獲得高純度的重組 蛋白 TLR2(貨號(hào) RPA663Hu01)，蛋白序列信息如圖 3 所示，該蛋白的凝膠電泳圖 如圖 4 所示。
MGHHHHHHSGSEF- PSGL TEAVKSLDLS NNRITYISNS DLQRCVNLQA LVLTSNGINT IEEDSFSSLG SLEHLDLSYN YLSNLSSSWF KPLSSLTFLN LLGNPYKTLG ETSLFSHLTK LQILRVGNMD TFTKIQRKDF AGLTFLEELE IDASDLQSYE PKSLKSIQNV SHLILHMKQH ILLLEIFVDV TSSVECLELR DTDLDTFHFS ELSTG
圖 3 蛋白序列信息
用純化得到的重組蛋白，通過(guò) SDS-PAGE（純度>95%）免疫小鼠，獲得小鼠 抗人 TLR2 的單克隆抗體，并采用親和層析法獲得高特異性的純化抗體（貨號(hào) MAA663Hu21）， 免疫家兔制備兔抗人 TLR2 的多克隆抗體（貨號(hào) PAA663Hu01）。
獲得純化抗體后，通過(guò) Western Blot 對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行了一系列檢驗(yàn)，結(jié)果如圖 5 所示。
同時(shí)，我們還用人脾臟組織對(duì) 純化的抗體進(jìn)行了 IHC 驗(yàn)證（如圖 6），結(jié)果顯示在人脾臟組織中有 強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)，且主要集中于細(xì)胞膜 上。以上實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了抗人 TLR2 抗體的高特異性。
Cloud-Clone Corp.還用獲得的 高純度蛋白以及高特異性的抗體 作 為 原 料 ， 自 主 研 制 出 圖 6 IHC-P 檢測(cè)結(jié)果 人 TLR2 蛋白定量檢測(cè)試劑盒（貨 號(hào) SEA663Hu）。
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