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CUB And Zona Pellucida Like Domains Protein 1 (CUZD1)，其表達(dá)是受到子宮和輸卵管兩 個(gè)關(guān)鍵生殖組織中雌激素的嚴(yán)格調(diào)控的。分析表明，在子宮和輸卵管中，CUZD1 在 mRNA 水 平上表現(xiàn)出很強(qiáng)的時(shí)間、空間的特異性, 其表達(dá)位置僅限于子宮和輸卵管的上皮細(xì)胞表面。 核苷酸序列分析表明 CUZD1 全長(zhǎng) cDNA 含有一個(gè)由 1821 個(gè)核酸編碼的開(kāi)放閱讀框，該閱讀 框可被翻譯成 607 個(gè)氨基酸，包含一個(gè)單次跨膜區(qū)域以及一個(gè)短的胞內(nèi)蛋白片段。最近的研 究表明 CUZD1 的抗血清能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的附著和增殖，此外在懷孕后期的子宮中或（和） 胰蛋白酶激活胰腺腺泡細(xì)胞中也可能起到重要作用。

現(xiàn)在市面上商業(yè)化的 CUZD1 的產(chǎn)品非常少，Cloud-Clone Crop.針對(duì)這一重要蛋白生產(chǎn)了 一系列可用于科研的蛋白、抗體和檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品提供給廣大的科研人員。

首先通過(guò)抗原表位預(yù)測(cè)，功能結(jié)構(gòu)域分析，mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，重組蛋白可溶性預(yù)測(cè) 等多種分析方法，最終確定了用于重組表達(dá)的蛋白片段-人 CUZD1 (Pro218~Arg479)。該片段 位于胞外區(qū)，具有較強(qiáng)的抗原性，較易在原核中形成可溶表達(dá)。依據(jù) uniport 中 Q86UP6 所對(duì) 應(yīng)的蛋白及核酸序列設(shè)計(jì)引物如下，引物分別含有一個(gè) EcoRI 的酶切位點(diǎn)和一個(gè) XhoI 的酶切 位點(diǎn)，用于后期重組載體的構(gòu)建：

[ PRIMER INFORMATION ]

Upstream Primer: CGgaattcCCCTCCACCAACTCTGGC

Downstream Primer: CCGctcgagCTATCTCCCATAGTGTCCAAATAAGG

在基因克隆過(guò)程中采用高保真酶進(jìn)行擴(kuò)增，獲得一個(gè)片段大小約為 800bp 的 cDNA 片段。測(cè)序正確后，采用傳統(tǒng)的雙酶切法與大腸桿菌表達(dá)載體 pCC-GST 連接，并用于 后期的蛋白表達(dá)，測(cè)序結(jié)果如圖 1 所示。

圖 1 pCC-GST-rh CUZD1 T7 terminator primer 反向測(cè)序結(jié)果

pCC-GST 是由我公司自主構(gòu)造的原核重組表達(dá)載體，具有兩個(gè) 融合蛋白表達(dá)標(biāo)簽，his 標(biāo)簽和 GST 標(biāo)簽，該重組載體生產(chǎn)的蛋白不 但可用多種方法純化檢測(cè)，同時(shí)還可以提高蛋白的可溶性以及免疫原 性。在表達(dá)標(biāo)簽和多克隆位點(diǎn)間具有一個(gè)蛋白酶酶切位點(diǎn)，可用于重 組標(biāo)簽的去除。

經(jīng)過(guò) IPTG 誘導(dǎo)大腸桿菌進(jìn)行外源重組蛋白表達(dá)后，獲得一個(gè)大 小約為 59KDa 的重組蛋白（貨號(hào) RPQ635Hu01），如圖 2 所示。

預(yù)測(cè)其蛋白序列為圖 3 所示序列。

所獲得的序列經(jīng)過(guò) ncbi 序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，與人 CUZD1 的相似性為 100%，證明我們獲得 了正確的重組蛋白片段，如下圖 4 所示：

Sequence Alignment Results (NCBI reported):

采用鎳柱純化的方法獲得純化后的重組蛋白 CUZD1 后，制備出小鼠抗人 CUZD1 的單克 隆抗體，并采用親和層析的方法獲得高特異性的純化抗體（貨號(hào) MAQ635Hu21），同時(shí)免疫兔子 獲得兔抗人 CUZD1 的多克隆抗體（貨號(hào) PAQ635Hu01）。

對(duì)相應(yīng)抗體的質(zhì)量進(jìn)行了一系列檢測(cè)，包括 Western blot，IHC 等多種檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如 下圖（圖 5、6）所示。我們檢測(cè)了人胰腺癌細(xì)胞株 BXPC-3,如圖中顯示。我們?cè)谖磻言写笫?的子宮樣本檢測(cè)中未獲得信號(hào)，進(jìn)一步驗(yàn)證了 CUZD1 表達(dá)的特異性。

IHC 檢測(cè)過(guò)程中我們使用了人胰腺癌細(xì)胞的石蠟組織切片，檢測(cè)結(jié)果表現(xiàn)出很強(qiáng)的陽(yáng)性 信號(hào)，主要表達(dá)在細(xì)胞膜上。以上實(shí)驗(yàn)證明我們獲得了高質(zhì)量的人 CUZD1 抗體。

Cloud-Clone Corp.利用已獲得的蛋白及抗體研發(fā)出對(duì)應(yīng)的 ELISA 檢測(cè)試劑盒（ELISA Kit for CUB And Zona Pellucida Like Domains Protein 1 (CUZD1)，SEQ635Hu）。該試劑盒采用雙抗 夾心原理，捕獲抗體采用抗人 CUZD1 單抗，檢測(cè)抗體采用 CUZD1 多抗。標(biāo)準(zhǔn)品使用高純度 原核表達(dá)的重組蛋白（去除蛋白標(biāo)簽）。該試劑盒靈敏度及特異性高，適用于人源樣本中 CUZD1 含量的檢測(cè)。

以上相關(guān)產(chǎn)品，請(qǐng)查詢 www.cloud-clone.us。